细菌简单染色和革兰染色

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1、实验二细菌的简单染色和革兰染色一、实验目的1、学习无菌操作技术，掌握细菌涂片的制作方法。2、掌握细菌简单染色法和革兰染色法的原理及操作步骤，识别细菌的革兰染色结果。3、巩固显微镜油镜的使用方法。二、实验原理细菌生长于酸性、中性和碱性溶液时常带负电荷，所以通常采用带正电荷的碱性染料（如美蓝、甲紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。当细菌分解糖类产酸时，细菌所带正电荷增加易被带负电荷的酸性染料（如伊红、酸性复红或刚果红）着色。简单染色法就是只用一种染料使细菌着色以显示其形态的方法。革兰氏染色法（GramStaining）由丹麦病

2、理学家ChristianGram于1884年创立，是细菌学中很重要的鉴别染色法，因为通过此法染色，可将细菌鉴别分类为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）这两种类型。革兰氏染色法之所以能够将细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类，是因为这两类菌的细胞壁结构和成分不同。一般认为革兰阴性细菌的肽聚糖层很薄，脂肪含量高，经乙醇处理后部份细胞壁可能被溶解并改变其组织状态，细胞壁孔径大，不能阻止溶剂透入，因而将结晶紫与碘的复合物洗去而被脱色，再经蕃红复染就染成了红色；革兰阳性细菌的肽聚糖层较厚，经乙醇处理后

3、使之发生脱水作用而使孔径缩小，结晶紫与碘的复合物保留在细胞内而不被脱色。虽然如此，革兰染色的差异并不能完全认为是化学的差别，也有物理结构不同的结果，因为酵母菌细胞壁的成份完全和细菌不同，但具有革兰染色阳性反应。三、实验器材1、菌种：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、葡萄球菌、酵母菌、待鉴定的未知菌S1和S3。2、仪器及其他用品：显微镜、酒精灯、打火机、接种环、载玻片、盖玻片、擦镜纸、擦镜液、吸水纸、镜油、无菌牙签。3、简单染液：草酸铵甲紫染液、番红染液。4、革兰染液：草酸铵甲紫染液、革氏碘液、95%乙醇溶液、番红染液四、实验步骤（

4、一）简单染色1、载玻片的处理：从乙醇溶液中取出洗干净的载玻片，用吸水纸擦干，将要涂菌的部位在酒精灯火焰上烤一下，去除油脂，冷却待用。2、涂片:左手持菌液试管，右手持接种环在火焰上灼烧待冷却后，用接种环从试管枯草芽孢杆菌培养液中取一环菌，于载玻片中央涂成薄层（事先在背面做好标记圆圈）即可，或先滴一小滴无菌水于载玻片中央，用接种环从斜面上挑出少许，与载玻片上的水滴混合均匀，涂成一薄层。注意在拔或塞试管塞时，应将试管口在火焰处略加烧灼，最后将接种环在火焰上烧灼灭菌。3、干燥：涂片后室温下自然干燥。4、固定：手持载玻片一端使标本

5、面朝上，在酒精灯的火焰外侧快速来回移动2~3次，要求玻片温度不超过60℃，以玻片背面触及手背皮肤不觉过烫为宜，放置待冷后染色。固定的目的是杀死微生物，固定其细胞结构，保证菌体能牢固地粘附在载玻片上，以免水洗时被水冲掉。5、染色：在固定好的涂片标记处滴加1滴草酸铵甲紫染液，染色1min。6、水洗：缓慢冲洗染液，吸干。7、实验搭档改用大肠杆菌培养液和番红染液，同时操作以上步骤。8、镜检：观察两个标本，区分辨别染成的紫色和红色。（二）革兰染色1、制片：分别取大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、葡萄球菌、酵母菌、未知菌S1和S3的菌液制成涂

6、片，干燥，固定。2、初染：滴加1滴草酸铵甲紫染液，染色1min，水洗，吸干。3、媒染：再加1滴碘液覆盖涂片1min，水洗。4、脱色：用吸水纸吸去玻片上的残留水，用滴管滴加95%的乙醇脱色，轻轻摇动玻片直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。5、复染：滴加蕃红染液复染3min，水洗。6、镜检：吸干水后，盖上盖玻片观察标本，观察时注意细菌形态、大小、排列和颜色。（三）选做实验在干净的载波片上滴加半滴水，用无菌牙签取一点牙垢，涂抹在水滴上，制成涂片后，进行革兰氏染色后观察。五、实验结果与讨论1、革兰染色照片结果（见下一页）（1）枯草

7、杆菌图1枯草杆菌革兰氏染色结果，10×100如上图所示，枯草杆菌染色结果为紫色，是革兰氏阳性菌（G+）。注：图中红色箭头所指的特殊结构——芽孢。（2）酵母菌图2酵母菌革兰氏染色结果,10×100如上图所示，酵母菌染色结果为紫色，是革兰氏阳性菌（G+）。注：图中红色箭头所示为出芽现象。（3）金黄色葡萄球菌图3金黄色葡萄球菌革兰氏染色结果,10×100如上图所示，金黄色葡萄球菌染色结果为紫色，是革兰氏阳性菌（G+）。注：从图中可以清晰地观察到葡萄球状的细菌形态。（4）大肠杆菌图4大肠杆菌革兰氏染色结果,10×100如上图所示

8、，大肠杆菌染色结果为红色，是革兰氏阴性菌（G—）。（5）未知菌液S1图5未知菌液S1涂片革兰氏染色结果,10×100如上图所示，菌液中有两种主要的细菌。注：红色箭头所示的未知菌的染色结果为紫色，是革兰氏阳性菌（G+），由细菌形态推测为一种杆菌；蓝色箭头所示的未知菌的染色结果为红色，是革兰氏阴性菌（G—），由细菌形态推