实验三酵母核糖核酸的提取及测定(预习报告)

《实验三酵母核糖核酸的提取及测定(预习报告)》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。

1、生物化学实验预习报告实验三酵母核糖核酸的提取及测定一、研究背景RNA（核糖核酸）普遍存在于动物、植物、微生物及某些病毒和噬菌体内，是遗传信息的载体，由数量不等的核糖核苷酸通过磷酸二酯键连接而成。由于RNA在细胞内能够行使各种各样的生物功能，属酸性高分子化合物，参与蛋白质生物合成，调控基因表达，作为核酶催化生化反应活性，对维持生物体的正常发育有着重要作用。此外，由于RNA还具有较强的保湿性、抗氧化性、强烈的紫外光吸收性、天然助长性以及抗皱防衰、防病治癌等特殊功能，[1]人们在研究基础理论的同时逐渐开始对RNA制剂的开发及应用进行探索。RNA制剂是以RNA及其衍生物为材料，经加工制成的产品，主要包

2、括从富含RNA的生物体中的提取物、自溶物或者降解产物加工制成的各种商品。目前，人们已经开始逐渐接受含RNA制剂的各种产品，需求量日益攀升，RNA制剂已广泛应用于医药、食品、农业、日化、环境保护等方面，具有广阔的商业前景，形成了一大新兴产业。但不管是理论研究还是实际应用，都面临一个问题：RNA往往与细胞内的其他化合物混在一起，离体之后稳定性差、含量低，采用廉价、合适的手段分离纯化得到RNA显得至关重要。当然，人们已经摸索出来了多种多样的方法，这些方法各有特点，但其基本的思路和程序大致相似，基本战略也是有规律可循的。另外，近年来RNA试剂盒的出现使方便、快速提取纯度高、完整性好的RNA分子也实现了

3、可能。二、研究目标1.了解RNA制剂开发应用的前景和基本思路；2.掌握RNA分离纯化的设计思想及主要的操作细节；3.学习酵母RNA提取和测定的操作方法。三、研究策略1.选材即选取富含RNA的生物材料，微生物由于其原料易获得性被广泛应用于工业上大量生产RNA的原料。2.提取提取RNA的方法有很多种，如浓盐法、稀碱法、混合盐法、苯酚法、表面活性剂法等[2]，但在工业生产上应用最多的还是稀碱法和浓盐法。两种方法的原理不同，浓盐法是原理是在加热条件下，高浓度NaCl改变细胞膜的通透性，使RNA释放出来；稀碱法是利用碱使微生物的细胞壁溶解，释放RNA。两种方法各有特点，浓盐法的破壁率低，但提取的RNA纯

4、度比稀碱法要高；稀碱法的破壁效果好，消耗时间短，能耗低，但提取RNA纯度较低，适于工业化生产。在实际中应根据具体情况及要求选择合适的方法。3.提纯提纯过程中常需要去除的杂质是蛋白质。通常采用等电沉淀法使RNA沉淀出来，使其与杂质分离，但有资料显示该法不能有效分离RNA和蛋白质，且RNA损失率较高。另外，也可使用盐析法、等电沉淀法析出蛋白质或蛋白酶降解法除去蛋白质。4.含量测定测定RNA的含量可通过测定核糖核苷酸的糖、碱基或者磷酸来实现。目前有三种方法，定磷法、戊糖测定法和紫外吸收法。定磷比色法准确、微量、快速，是测定RNA含量的最好方法；戊糖测定法通过糖的颜色反应测定RNA，简单、快速，当样品

5、中有粘多糖和蛋白质存在时会有干扰；紫外吸收法简单、快速、微量，但易受到蛋白质及含有共轭双键物质的干扰。四、研究方案及可行性分析本实验以食品用干酵母粉为材料，采用浓盐法提取核糖核酸并用紫外分光光度法测定制品中RNA的含量。方案合理，实验材料及器具实验室均可提供，时间上也允许，故本方案具有可行性。五、具体实验设计1.实验仪器及试剂仪器：UV9600紫外分光光度计、JP-100架盘药物天平、恒温水浴锅、TDL-40B低速离心机；器具：微量可调手动移液器、普通大试管、25ml容量瓶、50ml容量瓶、研钵；试剂：10%NaCl溶液、6MHCl、95%乙醇、2%的氨水、RNA沉淀剂、蒸馏水；材料：食品用干

6、酵母粉。2.实验步骤（1）酵母核糖核酸的提取（7h）提取称取7g酵母粉→研磨至面粉状→转移至三角瓶，加50ml10%NaCl溶液→彻底悬浮浸润→沸水浴浸提40min→提取液。分离提取液→冰浴冷却至少10min→3500r/min离心30min→上清液沉淀RNA上清液→小烧杯中冰浴冷却至10℃以下→搅拌下6MHCl调节pH至2.0~2.5→冰浴4h。洗涤纯化冰浴后悬浮液→3500r/min离心15min→RNA沉淀→约15ml95%乙醇彻底悬浮搅拌洗涤→3000r/min离心10min→RNA沉淀（重复洗涤、离心三次）。干燥硫酸纸于80℃烘箱干燥→称重→边缘折叠成框→转移RNA沉淀涂布于硫酸纸上

7、→80℃烘箱干燥5min→称重→转移大部分RNA制品于玻璃匀浆器内→称重剩余样品及硫酸纸→记录数据，计算纯度及产率。（2）核糖核酸含量的测定（紫外分光光度法）（1h）匀浆液制备（15min）玻璃匀浆器内加入5ml蒸馏水→匀浆至均一的胶体溶液→转入小烧杯（10ml左右蒸馏水分次清洗并入）→混匀，2%氨水调pH7.0→转入25ml容量瓶，定容，混匀含量测定（40min）取两支试管，按下表操作管号RNA