山大生化实验报告实验一、三酵母rna的提取和含量测定

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1、酵母RNA的提取和含量测定姓名：周超学号：201100140067班级：11级生命基地同组者：刘炳煜时间：2011年3月26fl【实验目的】1.掌握稀间法提取酵母RXA的原理和方法2.了解测量核算浓度的不同方法的原理3.掌握紫外吸收法测定核酸浓度的原理和技术4.学会使用紫外分光光度计5.学会使用离心机【实验原理】1.酵母RNA提取的原理：(1)酵母核酸屮RNA含量较多，DNA则少与2%(2)RNA可溶于碱性溶液，当碱被中和后，可加入乙醇使其沉淀，由此可制得粗RNA制品。(3)用碱提取的RNA有不同程度的降解

2、。2.紫外吸收法测RNA含量的原理：(1)核酸具冇吸收紫外线的性质，在波长260nm处有最大吸收，且在一定浓度范围内光吸收值与浓度成止比(5-45ug/ml),符合朗伯■比尔定律。(2)优点：操作简单，样品用量少，不用显色，测完后样品可以继续使用。(3)缺点：当有大分子物质存在吋，也会有一定的吸收，会影响测量精确度。【实验试剂】1.提取试剂：0.2%NaOH溶液酸性乙醇：5ml浓HC1加入到500ml95%乙醇中混匀95%乙醇无水乙醇1.含量测定试剂：0.2%NaOII溶液pH试纸(1-14)标准核酸：20

3、0ug/ml待测样品核酸【实验步骤】(1)将4g干酵母粉放入200ml锥形瓶中,加入40ml0.2%的NaOH溶液混匀。(2)沸水浴30min,然后用流水冷却(3)4000转/分离心15秒，保留上清液(4)在上清液中加入40ml酸性乙醇，边加边搅拌，静置5分钟左右，再4000转/分离心5分钟，保留沉淀(5)用20ml95%乙醇分两次洗涤沉淀，每次洗后3000转/分离心5分钟(6)用20ml无水乙醇分两次洗涤，每次洗后3000转/分离心5分钟(7)收集沉淀于滤纸上备用。2.RNA含量的测定：(1)准确称取0.

4、2-0.25g(因提取到的RNA粗品量太少，本次实验使用的R7A量仅为0.1910g)样品核酸,加2ml0.2%NaOH溶液和lml水溶解，调成糊状(2)再加入50ml左右的水溶解，边溶解边传移到100ml烧杯屮，用0.2%NaOH调至中性，定容至100ml(3)再分3次取2.5n)l定容至100ml备用，做平行实验(4)取200ug/ml的标准RXA20ml,加水定容至100ml,得到40ug/ml的RNA备用(5)再将40ug/ml的RNA按表一加样稀释，得到5ug/ml>10ug/ml>20ug/ml

5、>30ug/ml>40ug/ml的标准溶液(6)用紫外分光光度计测量吸光值，绘制标准曲线，计算样品纯度。【实验结果】表一管号标准曲线样品012345678标准RNA(40ug/ml)/ml02.55101520//水/ml2017.5151050///标准RNA浓度/(ug/ml)0510203040//01)值00.0970.1910.3830.6210.7670.6380.6480.638图一标准曲线标准曲线y=0.0196X计算：三次平行实验平均0D值=0.6413,根据标准曲线，得到稀释后的RNA浓

6、度为32.719ug/ml,则样品RNA的纯度为(32.719*40*100)/(0.1910*10”)=0.6852【思考讨论】实验结果分析：本次实验最终的测定结杲为，RNA的纯度为6&52%,造成这个结杲的原因：(1)用稀碱法提取的RNA有不同程度的降解(2)人在操作过程屮，会呼出少量的RA酶，也会降解样品RNA,导致纯度下降。(3)提取的样品屮冇细胞内含物，也会对纯度冇影响。注意事项：(1)离心机使用的注意事项：离心时，离心管要平衡对称放置，既耍位置对称,又要重量平衡。否则会造成离心机损坏。(2)提

7、取RA吋，用酒精沉淀吋，一定要充分，边加酒精边搅拌上清液。(3)提取RXA时，用酒精洗涤沉淀时，一定要把酒精与沉淀混匀，这样做有利丁•增高捉取浓度。(4)RNA含量测定中，若RNA样品少与2.0g时，取2.5ml的母液，定容至100ml；若RM样品量为2.0-2.5g,则取2.0ml的母液，定容至100ml,这样稀释之后,可以保证测量液的吸光值在标准曲线之内。(5)使用紫外分光光度计测量RXA含量时，一定要注意做平行实验，即分别取3次2.0ml的母液，分别定容至100ml,制成3个测量液，切记平行实验不是

8、把相同的测量液测三次。