酵母RNA含量测定

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1、realtimeRT-qPCR是检测样本中特定基因表达量的有效方法，包含逆转录步骤和定量PCR步骤。好的开始是成功的一半，获得高质量的、能正确反应样品中转录情况的RNA，对于其后的定量结果，自然是非常重要的。MikaelKubista，教授,R&DTATAABiocenter主任：RNA质量包含两个方面：样品的纯度和RNA的完整性。样品纯度可以在样品稀释时得到改善。我们通常通过Nanodrop测量吸光值来检测纯度。260/280吸光值的比率应该在2至2.1的范围内，并且是“漂亮”的吸光光谱曲线。

2、230nm吸收峰应该低。我们通过利用Experion(Bio-Rad)记录电泳图（electropherogram）检测RNA的质量。当然，最理想的结果是得到很清晰的18S和28S峰值。但RNA的完整性是无法改善的，保存样品、固定样品和来源于富含降解酶的器官的样品RNA完整性通常不好。检测RNA质量的两个原因，一是想要知道某一个实验得到的RNA质量，从而选择适当的RT-qPCR方法，二是识别出研究中的样品的质量是否比正常情况差，避免导致偏差或者不正确的结果。JoVandesompele，根特大学

3、医院（GhentUniversityHospital）医学遗传学中心高质量的RNA应该是完整的、不含抑制剂的。我们习惯利用毛细管凝胶电泳系统来评价28S和18S条带的比率，过程很快速并且只需要很少量的RNA。值得注意的是，这个比率是组织或者细胞特异的，所以理想的是你应该将样品与一个同样细胞来源的完整对照比较。在芯片分析（微阵列研究）中通常都要求进行RNA质量分析，现在许多定量PCR领域的人们开始考虑RNA质量这个因素。我们最近在发表的文章说到评价用于PCR分析的RNA的质量尤为重要，这是由于并非

4、每个基因降解水平都相同，严重时甚至可以使你的实验结果出错(Perrez-Novoetal.,2005)。我们主要的结论是：参考基因(referencegene)的稳定性在完整样品（intact）和在降解样品中是有差别的，因此你不应该将完整的样品和降解的样品相比，尤其是你在研究精确的表达差异时。检测核糖体吸收峰值是目前评价RNA完整性的金标准，但其实rRNA仅是mRNA成分完整性的一个代言标记。我们开发了一种基于PCR的分析实验，可以比较一个特定基因的5'和3'端amplicons的比率。通过比较

5、未知样品和完整的对照样品的比率，我们能够利用PCR分析实验衡量mRNA的完整性，与电泳评估/rRNA评估相比更具有直接相关性。为了评价制备RNA的纯度（例如没有抑制剂），我们实行qPCRSPUD分析，既简单易用又免费(Nolanetal.,AnalBiochem,inpress).TimHunter，英国伦敦大学学院（UCL）：你需要建立灵活的操作流程来分离高质量的RNA。样品类型决定着哪一种分离方法是最好的。通常，初步的质量监控检查是在NanoDrop分光光度计进行核酸定量的时候，260吸收峰

6、外的读数值可指示污染情况。260/280的比率应该在1.8至2.1的范围内。同样非常关键的，是要保证实验所用的RNA质量（全长、完整性）不打折扣，因此，我们通常利用Agilent2100Bioanalyzer检查RNA的完整性，并根据rRNA峰值的完整性判断RNA样本的情况，选择下一步实验适合的方法。假如有证据显示重要样品有降解，我们会同时检测一个在该样品中已知稳定的管家基因，来观察是否出现由于转录产物不完整而导致管家基因在这个样本中的表达改变。当探针并非处于外显子—外显子边界时，我们会同时选择

7、中/高表达的管家基因作(-)RT对照，以检查基因组DNA的污染情况。样品可在37oC下孵育2-4小时，并重新在Bioanalyze上分析降解情况，以检查核酸酶的活性CristinaHartshorn,美国Brandeis大学生物学系：我认为高质量RNA是指正确代表细胞内容物的转录池（transcriptpool）的RNA。我们实验室非常注重RNA的回收率，尤其是来源于像单个细胞等的微量样品中RNA的纯化，需要尽量减少可能导致核酸降解的操作步骤。因此，我们开发了一种能在同一支试管里连续进行收集细胞

8、、裂解细胞、去除蛋白杂质、逆转录和实时定量PCR等操作的整体流程。这种整个实验在单个试管内进行的方法称为PurAmp(Hartshornetal.,2005a;Hartshornetal.,2005b)，该方法基于稀释法，并且不需要将RNA结合到任何纯化基质上去，因此保证了实质上纯化得到完整的RNA库。此外，我们觉得转录产物的完全去蛋白化对于RT引物与模板的正确结合、以及最终模版定量的精确性和可重复性来说是十分必要的，这就像对基因组DNA模板制备来说是必需的一样。PurAmp方法有时要求一个DN