实验十酵母核糖核酸的分离及组

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1、实验十酵母核糖核酸的提取及RNA的含量测定（苔黑酚法）实验目的：了解核酸的组分掌握提取核酸和鉴定核酸组分的方法掌握苔黑酚法测定RNA含量的原理和方法。实验原理：酵母中RNA含量较多,含量可达2.67～10.0%，DNA很少（0.03～0.516％），提取RNA以酵母最为理想。RNA可溶于碱性溶液，研磨后离心去除沉淀（细胞碎片），当碱被中和后，上清液中加入乙醇可以使解聚的核糖核酸沉淀，离心弃上清液，可得到RNA的粗制品。RNAversusDNA-Stabilityissues一、核酸的水解1.碱水解RNA的磷酯键易被碱水碱、DNA的磷酯键不易

2、被碱水解。例如，在0.1mol/LNaOH溶液中，RNA几乎可以完全水解，生成2′-或3′-磷酸核苷；DNA在同样条件下则不受影响。这种水解性能上的差别，与RNA核糖基上2′-OH的邻基参与作用有很大的关系。在RNA水解时，2′-OH首先进攻磷酸基，在断开磷酯键的同时形成环状磷酸二酯，再在碱的作用形成水解产物。一、核酸的水解2.酸水解核酸分子中的糖苷键和磷酸二酯键在酸性条件下水解切断。其中糖苷键比磷酸二酯键更容易遭到水解。核糖核酸含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以测出上述组分的存在。（1）核糖糠醛糠醛+甲

3、基苯二酚（地衣酚、苔黑酚）鲜绿色的复合物（670nm）Fe3+H+（2）嘌呤碱+AgNO3嘌呤碱的银化物（3）（NH4)2MoO4+H2SO4H2MoO4+(NH4)2SO4H3PO4+12H2MoO4H3P(Mo3O10)4+12H2O+抗坏血酸钼蓝（660nm）浓氨水器材和试剂器材：乳钵、150ml锥形瓶、水浴锅、量筒、吸管、滴管、试管及试管架、烧杯、离心机、漏斗试剂：0.2%氢氧化钠溶液、5%硝酸银溶液冰醋酸、干酵母、95%乙醇、10%硫酸溶液、浓氨水苔黑酚三氯化铁溶液定磷试剂（1）17%硫酸溶液将17ml浓硫酸（比重1.84）缓缓加入到

4、83ml水中。（2）2.5%钼酸铵溶液将2.5g钼酸铵溶于100ml水中。（3）10%抗坏血酸溶液10g抗坏血酸溶于100ml水中，贮棕色瓶保存。溶液呈淡黄色时可用，如呈深黄或棕色则失败，需纯化抗坏血酸。临用时将上述3种溶液与水按如下比例混合。17%硫酸溶液：2.5%钼酸铵溶液：10%抗坏血酸溶液：水=1:1:1:2(V/V)操作1、提取核糖核酸5g酵母+30ml0.2%氢氧化钠研磨均匀锥形瓶，微波加热5分钟，冷却，离心（4000r/min）10分钟，取上清液，滴加冰醋酸使提取液呈酸性（pH5—6，石蕊试纸试之），加30ml95%乙醇溶液。注意

5、要一边搅拌一边缓缓倾入。待核糖核酸沉淀完全，离心（3000r/min）3分钟，95%乙醇（每次约10ml）洗涤沉淀两次（即离心）。2、组分鉴定提取核酸+10%硫酸溶液5ml10分钟水解液组分鉴定：1）嘌呤碱:硝酸银溶液1ml+过量浓氨水,出现沉淀到沉淀消失，再滴加1ml水解液，观察有无嘌呤碱的银化合物沉淀。（注意先后顺序）2）核糖水解液0.5ml+苔黑酚三氯化铁溶液1ml，加热至沸1分钟，观察溶液颜色变化。沸水浴3）磷酸水解液1ml+定磷试剂1ml观察现象实验结果：水浴苔黑酚法测RNA的含量1、标准曲线的绘制012345RNA标准液ml00.4

6、0.81.21.62.0蒸馏水ml2.01.61.20.80.40苔黑酚试剂ml2.02.02.02.02.02.0混匀，沸水浴25—45min,冷却，测各管A670nm,以A670nm为纵坐标，RNA量（ug）为横坐标作图。2、样品的测定1.0ml样液+1.0ml蒸馏水+2.0ml苔黑酚试剂，混匀，沸水浴25—45min,测A670nm，根据标准曲线求得RNA的质量（ug）.