基于发光纳米材料构建的电致化学发光免疫传感器应用于心肌肌钙蛋白-i检测

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单位代码１０６３５学号１３３１６００１１１２？１１邹忠義！禾聲硕±学位论文基于发光纳米材料构建的电致化学发光免疫．％传感器应用于必肌肌钩蛋白－Ｉ检测■［论文作者：周堇＇指导教师．：袁若教授学科专业：分析化学研充方向：纳米材料及电化学生物传感器提交论文日期；２０１６年０４月２０日论文笞辩日期：２０１６年０５月３０日学位段予单位：西南大学一中国？重庆—２０、’１６年４月＊？？１．？－、，Ｊ．， 魏创性声明■学位论文题目：基于发光纳米材料构建的电致化学发光免疫传感器应．－■甩于也肌肌巧蛋白Ｉ檢测；－）本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研巧成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中已加了特别标注。对本研究及学位论文撰写曾做出贡献的老师、朋友、同Ｉ、Ｉ仁在文中作了明确说明并表示衷屯感谢。如？学位论文作者：Ｍ／可皆签字日期：６年月么日■５＿．－Ｉ：Ｉ学位论文版极使用摸权书Ｉ本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规Ｉ定，有权保留并向国家有关部口或机构送交论文的复印件和磁盘，允！许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院（筹）可将学位入！论文的全部或部分内容编有关数据库进行检索，可Ｗ采用影巧、缩＼印或妇描等复制？手段保存、汇编学位论文。．Ｉｔ‘；，１ｆ（保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：□不保密，．，□保密期限至年月止）。学位论文作者签名：巧葦导师签名：訓ｊ签字日期：６年月么日签字日期：年月２４＾．ＩＩＩ 目录摘要..........................................................................................................................IABSTRACT..............................................................................................................III第一章绪言..............................................................................................................11.1电致化学发光概述.................................................................................................11.2发光纳米材料.........................................................................................................11.2.1发光纳米材料概述.............................................................................................11.2.2功能化发光纳米材料在电致化学发光免疫传感器领域的应用.........................21.2.3自发光纳米材料在电致化学发光免疫传感器领域的应用.................................31.3生物传感器简介.....................................................................................................41.4电致化学发光免疫传感器概述..............................................................................51.5心肌肌钙蛋白简介.................................................................................................61.6本文研究思路.........................................................................................................7第二章基于自增强Ru(II)复合物的超灵敏电致化学发光免疫传感器用于检测心肌肌钙蛋白I.............................................................................................................92.1引言........................................................................................................................92.2实验部分...............................................................................................................102.2.1试剂和仪器........................................................................................................102.2.2制备金纳米棒....................................................................................................112+2.2.3制备自增强L-Cys@Ru(dcbpy)3分子化合物..................................................112+2.2.4制备anti-cTnI/AuNRs/L-Cys@Ru(dcbpy)3探针（Ab2生物复合物）............112.2.5免疫传感器的制备............................................................................................122.2.6测量方法............................................................................................................122.3结果与讨论...........................................................................................................132.3.1不同纳米材料的表征........................................................................................132.3.2L-Cys@Ru(II)复合物的稳定性.........................................................................142.3.3L-Cys@Ru(II)复合物的可能发光机理..............................................................142.3.4ECL免疫传感器的电化学表征.........................................................................152.3.5Ab2生物结合物孵育时间的优化......................................................................162.3.6放大策略的ECL表征.......................................................................................162.3.7免疫传感器对cTnI的ECL响应......................................................................172.3.8稳定性，重现性和选择性.................................................................................182.3.9实际样品检测....................................................................................................192.4结论......................................................................................................................19第三章基于胆碱氧化酶和鲁米诺还原的Pt@Au杂交纳米花的双重放大体系的超灵敏免疫分析...........................................................................................................21 3.1引言......................................................................................................................213.2实验部分..............................................................................................................223.2.1试剂和仪器........................................................................................................223.2.2制备luminol-Pt@AuNFs纳米复合物...............................................................223.2.3制备Ab2/luminol-Pt@AuNFs/ChOx纳米复合物.............................................233.2.4合成MnO2@MWNTs纳米复合物....................................................................233.2.5免疫传感器的制备............................................................................................233.2.6电极的测试过程及响应原理.............................................................................243.3结果与讨论...........................................................................................................253.3.1纳米材料表征...................................................................................................253.3.2luminol-Pt@AuNFs的紫外吸收谱图................................................................253.3.3luminol-AuNFs及luminol-Pt@AuNFs的X射线电子能谱图.........................263.3.4免疫传感器的电化学表征.................................................................................273.3.5不同二抗标记物的响应性能对比.....................................................................283.3.6免疫传感器的响应性能....................................................................................293.3.7免疫传感器的稳定性、选择性以及重现性......................................................303.3.8免疫传感器的初步应用....................................................................................303.4总结......................................................................................................................31第四章基于银纳晶和联吡啶钌的双波长比率法电致化学发光能量转移免疫传感器..............................................................................................................................324.1引言......................................................................................................................324.2实验部分.............................................................................................................334.2.1试剂和仪器........................................................................................................334.2.2银纳米簇的制备................................................................................................332+4.2.3Ru(bpy)3/MWNTs的制备................................................................................342+4.2.4制备BSA/Ab2/Ru(bpy)3/MWNTs探针...........................................................344.2.5免疫传感器的制备............................................................................................344.2.7电极的测试过程及响应原理............................................................................354.3结果与讨论..........................................................................................................354.3.1纳米材料表征...................................................................................................354.3.2AgNCs的电化学性质........................................................................................364.3.3合理的ECL-RET机理......................................................................................364.3.4AgNCs的ECL发光机理..................................................................................374.3.5生物传感器对cTnI的分析性能.......................................................................384.3.6免疫传感器的选择性........................................................................................394.3.7免疫传感器的初步应用....................................................................................394.4总结......................................................................................................................40 参考文献..................................................................................................................41作者部分相关论文题录...........................................................................................48致谢..........................................................................................................................49 摘要基于发光纳米材料构建的电致化学发光免疫传感器应用于心肌肌钙蛋白-I检测分析化学专业硕士研究生周莹指导教师袁若教授摘要随着纳米材料迅速的发展，在纳米材料表面富集大量电致化学发光（ECL）活性分子合成发光功能化纳米材料，以及研究具有ECL性质的自发光纳米材料，受到人们的广泛关注。我们将发光纳米材料作为信号探针，构建高选择性、高灵敏度、低背景的电致化学发光免疫传感器分析方法。急性心肌梗塞（AMI）是临床常见的急性多发病，正确诊断及时救治对挽救濒死心肌，对改善和降低AMI患病率和死亡率具有重要意义。心肌肌钙蛋白（cardiactroponin，cTn）是心肌肌肉收缩的调节蛋白。其中心肌肌钙蛋白I（cTnI）的分泌和心肌梗塞发病率密切相关，在医学检测中cTnI被认为是心肌梗塞检测的黄金标准心脏生物标记物。我们将ECL免疫传感器的特性和纳米材料特有的优点结合用于实现在患病的早期阶段高效、低浓度、快速的cTnI测定。该方法不仅无需复杂繁琐的试剂加入过程，操作过程简单，还缩短了能量传递过程，减少能量损失成功地实现了目标分析物的高灵敏、低成本检测，成为生物分析领域一个新的发展趋势。本论文主要从以下几个方面开展研究工作：1.基于自增强钌(II)复合物的超灵敏电致化学发光免疫传感器用于检测cTnI传统的ECL免疫传感器为了提升发光试剂的发光效率通常将共反应试剂加在检测底液中，但溶液中许多不利的微环境因素限制了ECL分析技术的检测灵敏性。2+在本工作中，我们将共反应试剂（L-cysteine）和发光试剂（Ru(dcbpy)3）连接在一个分子上获得一种新颖的自增强ECL发光试剂（L-cys@Ru(II)）。自增强钌(II)复合物的应用不仅避免了将共反应试剂和发光试剂添加于测试底液中，简化了测定过程、缩短了分析时间，同时实现分子内反应缩短了能量传递路径、减少了能量损失，有效的提高了ECL发光信号。随后，钌(II)复合物和二抗（anti-cTnI）通过Au-N或Au-S共价键被固载在金纳米棒（AuNRs）上，这不仅实现更多自增强钌(II)复合物的固载，还合成了稳定的Ab2生物复合物作为信号探针。最后，ECL免疫传感界面的构建是通过电化学沉积树枝状金纳米粒子（GNDs）在玻碳电极（GCE）表面来固载捕获抗体（anti-cTnI）。目标传感器展示出高的灵敏度和宽的线性范围，cTnI的检测线性范围为0.25pg/mL～0.1ng/mL，检出限为0.083pg/mL(S/N=3)。该方法具有制备简单、操作简便、灵敏度高等优点，为临床免疫测定法I 西南大学硕士学位论提供了新的参考。2.基于胆碱氧化酶和鲁米诺还原的Pt@Au杂交纳米花的双重放大体系的超灵敏免疫分析鲁米诺作为一种广泛研究的ECL发光试剂，具有，低氧化电位、高发光效率和强发光强度的优点。近年来，众多课题组一直在寻找合适的方式将鲁米诺固载在电极表面用于生物检测。本工作中，首先利用鲁米诺的还原性合成多功能的Pt和Au杂化的花状纳米复合物，同时在还原反应中发光基团鲁米诺连接在纳米复合物上形成纳米复合物（luminol-Pt@AuNF）；随后胆碱氧化酶（ChOx）通过Pt-N或Pt-S共价键被固载在纳米复合物的表面，从而构建了包括ChOx催化胆碱生成H2O2和H2O2被Pt@AuNFs模拟酶原位催化分解的双重模拟酶放大体系，形成的··−H2O2被Pt@AuNFs模拟酶催化分解为OH和O2直接催化促进鲁米诺的ECL发光，显著的增强了传感器的灵敏度；最后，我们采用MnO2功能化的碳纳米管（MnO2@MWNTs）来固载Ab1修饰免疫传感界面。综上所述，目标免疫传感器对-1-1-1cTnI的线性范围宽（0.05pgmL～0.1ngmL）、检出限低（83fgmL）、选择性-1高、重现性好，对cTnI检测限达到fgmL级别，在免疫测定领域有潜在的应用价值。2+3.基于银纳米晶和Ru(bpy)3之间的双波长比率法共振能量转移电化学发光免疫传感器用于心肌肌钙蛋白I检测本工作中，通过简易的电沉积法直接在电极表面合成银纳米簇（AgNCs），并首次观察到AgNCs在458nm波长有显著的阴极ECL发光。我们通过场发射扫描电子显微镜（FE-SEM），X射线衍射（XRD），以及荧光光谱（PL），表征了AgNCs2-的形态特征，并探讨了其光学性质。并采用过二硫酸离子（S2O8）促进AgNCs的ECL发光，通过共反应试剂路径阐明AgNCs的ECL发光机制。相较于在溶液中传统的AgNCs，我们制备的AgNCs采用一个简单而快速的电沉积方法合成，并产生了高发光效率。但是AgNCs的ECL效率低于鲁米诺、联吡啶钌等传统的ECL试剂的发光效率，同时AgNCs的ECL激发电位过高，这限制了AgNCs的生物检2+测应用。我们设计了基于从AgNCs到联吡啶钌（Ru(bpy)3）之间的双波长比率法电致化学发光能量转移（ECL-RET）免疫传感器用于cTnI的灵敏检测。AgNCs的2+ECL激发波长与Ru(bpy)3的紫外-可见吸收峰显示了良好的光谱重叠，说明基于ECL信号在458nm处淬灭并在650nm处增强可实现双波长比率法ECL-RET。最2+后，羧基化多壁碳纳米管作为纳米载体固载Ru(bpy)3合成纳米复合物2+（Ru(bpy)3/MWCNTs）。通过测量ECL650nm/ECL458nm的比例，我们可以更加准确的检测从1.0pg/mL到1.0ng/mL范围的cTnI浓度。这项工作提供了一个新颖的发光试剂AgNCs生物检测应用，也丰富了ECL-RET分析体系的检测方法。关键词：电致化学发光；免疫传感器；发光纳米材料；心肌肌钙蛋白-III AbstractStudiesonElectrochemiluminescenceImmunosensorsbasedonLuminescentNanomaterialsforCardiacTroponinIAnalyticalChemistryMasterPostgraduate：YingZhouSupervisor：RuoYuanABSTRACTWiththerapiddevelopmentofnanomaterials,electrochemiluminescentfunction-alizednanomaterialsandluminousnanomaterialsincludingsemiconductorquantumdots,carbondots,andmetalnanoclusters,havebeenusedasanalyticalprobetoconstitutesandwichimmunoassay.Electrochemiluminescenceimmunosensorsasausefulandavailabledetectiontoolhavebeenthefocusofrecentinvestigations,duetothemeritsofhighsensitivity,goodselectivity,lowbackground.Recentyears,acutemyocardialinfarction(AMI)hasbeenlistedastheleadingcauseofmorbidityandmortalityamongcardiovasculardiseases.ThecardiactroponinI(cTnI)isakindofcardiaccontractionmuscletoregulateprotein.ItisreportedcTnIhasbeenrecognizedasthegoldstandardcardiacbiomarkersinthedetectionofAMI,becauseofitssuperiorcardiacspecificityandselectivity.Therefore,highlyefficientandreliableanalyticaltechniquesarenecessaryformeasuringcTnIpresentatultralowlevelsduringearlystagesofdiseaseprogress.Thus,combiningtheadvantagesoftheECLimmunosensorandnanomaterialsplaysanimportanttheoreticalandpracticalvalueforultrasensitivedetectionofcTnI.Theapplicationoftheluminousnanomaterialsnotonlyavoidedtheadditionofanycoreactantintotestingsolutionforsimplifyingtheoperation,butalsoachievedtheintramolecularreactionforimprovingtheECLsignalduetoshorterelectrontransferpathandlessenergyloss.Itisexpectedtoprovideapromisingapproachforthedetectionofawiderangeofmolecularanalytes.Inourpaper,researchworkiscarriedoutfromtheaspectsasfollows:Part1StudyonultrasensitiveelectrochemiluminescentdetectionofcardiactroponinIbasedonaself-enhancedRu(II)complexTopromotetheluminousefficiencyofluminophore,traditionalelectrochemilumines-cence(ECL)immunoassayusuallyadoptstheaddingofcoreactantintotestingsolution.However,manyadversemicro-environmentalfactorsinthesolutionarealimitingfactorinECLanalyticaltechniquesandreceivedextensiveattention.Inourwork,aself-enhancedECLluminophorewassynthesizedbycombiningthecoreactant(L-cysteine)andtheluminophor(Tris(4,4´-dicarboxylicacid-2,2´-bipyridyl)III 西南大学硕士学位论2+ruthenium(II)dichloride(Ru(dcbpy)3))toformoneRu(II)complexandwasappliedtofabricateareagentlessimmunosensorforthedetectionofcardiactroponinI(cTnI)forthefirsttime.Theapplicationoftheself-enhancedRu(II)complexnotonlyavoidedtheadditionofanycoreactantintotestingsolutionforsimplifyingtheoperation,butalsoachievedtheintramolecularreactionforimprovingtheECLsignalduetoshorterelectrontransferpathandlessenergyloss.Andthengoldnanorods(AuNRs),duetotheirhighspecificsurfaceareaandgoodelectrocatalyticability,wereusedascarriersfortheimmobilizationofRu(II)complexandcTnIantibodytoobtaintheAb2bioconjugatesassignallabels.Inviewoftheseadvantages,theproposedimmunosensorachievedawidelinearrangefrom0.25pg/mLto0.1ng/mLwithanimpressivedetectionlimitof0.083pg/mLforcTnI(S/N=3).Theimmunosensorexhibitedadvantagesofsimplepreparationandoperation,highsensitivity.Part2Studyonultrasensitiveimmunoassaybasedonpseudobienzymeamplifyingsystemofcholineoxidaseandluminol-reducedPt@AuhybridnanoflowersLuminolservesasoneofthemostextensivelystudiedECLluminophore,whichhaslowoxidationpotential,highemissionyieldsaswellasstrongluminescence.Currently,greateffortshavebeenmadetowardtheapplicationsofsolid-stateluminolECLinsensorsbyemployingtheappropriateimmobilizationmethods.Thisworkdescribedanalternative“signalon”immunosensorforultrasensitivedetectionofcardiactroponinI(cTnI)bycombiningmulti-functionalluminol-reducedPt@Auhybridflower-likenanocomposite(luminol-Pt@AuNFs)andpseudobienzymesignalamplificationstrategy.Herein,theluminophorofluminolwasintegratedwiththePt@Auhybridnanoflowerstoformonenovelnanocomposite,whichnotonlyactedasasignalprobewithsignificantlypromotedECLefficiency,butalsoexhibitedaneffectiveplatformforanchoringlargeramountsofsecondaryantibody(Ab2)andcholineoxidase(ChOx).Meanwhile,ChOxandPt@AuNFsconstructingpseudobienzymeamplifyingsystemcouldinsitugeneratecoreactantwithhighlocalconcentrations,theECLofluminolinvolvingenzymaticreactionofChOxtogenerateH2O2insitu,thenH2O2subsequentlywascatalyzedbymimickingenzymeofPt@AuNFs,thusdramaticallyenhancedtheluminousintensityofluminol.ThesensinginterfacewasestablishedbyassemblingcTnIantibody(anti-cTnI)ontheMnO2functionalmultiwalledcarbonnanotubes(MnO2@MWNTs),whichexhibitedhigherelectricalconductivityandlargersurfaceareathanpureMWNTs.Withthecascadesignalamplification,ourproposedstrategy-1providedanultrasensitivedetectionofcTnIdowntothefemtogramlevel(17fgmL)-1-1withalinearrangeof4ordersofmagnitude(from50fgmLto0.1ngmL).TheIV Abstractimmunosensorwouldextendtheapplicationsinthefieldofimmunoassay.Part3Studyondual-wavelengthratiometricelectrochemiluminescenceimmunosensorbasedonresonanceenergytransferbetweensilvernanoclusterand2+Ru(bpy)3forcTnIdetectionInthiswork,wefirstobservedthatelectrodepositedsilvernanocluster(AgNCs)exhibitedremarkablecathodicECLemissionspectrumatpeakwavelengthof458nmforthefirsttime.Herein,themorphologicalcharacteristicsandopticalpropertiesofAgNCswereinvestigatedbyfieldemissionscanningelectronmicroscopy(FE-SEM),X-raydiffraction(XRD),aswellasphotoluminescence(PL).Finally,peroxydisulfate2-(S2O8)wasemployedtopromotetheECLoftheAgNCs,andthenthemechanismwaselucidatedincoreactantpath.ComparedwithtraditionalECLbasedonAgNCs,ourproposedAgNCsweresynthesizedusingasimpleandfastelectrodepositionmethodandobtainedthehighluminousefficiency.However,theanodicECLintensityofAgNCsismuchlowerthanthatofconventionalluminescentreagentssuchasluminolor2+Ru(bpy)3,anditsapplicationofbiologicaldetectionislimitedduetoAgNCswithahighexcitedpotentialinECLprocesses.Adual-wavelengthratiometricelectrochemi-luminescenceimmunosensorforsensitivedetectionofcardiactroponinI(cTnI)was2+firstdesignedbasedonresonanceenergytransfer(RET)fromAgNCstoRu(bpy)3.Herein,theECLemissionoftheAgNCsat458nmshowsgoodspectraloverlapwith2+2+theUV−visabsorptionpeakofRu(bpy)3,indicatingthatAgNCsandRu(bpy)3willproduceECL-RETwithhighefficiency.Thus,adual-wavelengthratiometricECL-RETsystemwasachievedbasedontheECLsignalsquenchingat458nmandincreasingat2+650nm.Finally,carboxylatedMWNTswereemployedasnanocarriersforRu(bpy)32+loadingviatheamidereactiontoremainexcellentECLactivityofRu(bpy)3.BymeasuringtheratioofECL650nm/ECL458nm,wecouldaccuratelyquantifytheconcentrationofcTnIinawiderangefrom1.0pg/mLto1.0ng/mL.ThisworkprovidesanimportantapplicationforthebiodetectionofluminousAgNCsandalsoexpandsECL-RETanalyticalsystem.Keywords:electrochemiluminescence;immunosensor;luminousnanomaterials;cardiactroponinIV 第一章绪言第一章绪言1.1电致化学发光概述电致化学发光（Electrochemiluminescence或ElectrogeneratedChemiluminesc-ence，简称为ECL），是通过电化学方法引发的化学发光现象。通过电极对含有电致化学发光活性物质的体系施加一定的电压或是通过一定的电流，产生了某些特殊的物质，这些特殊物质之间或这些特殊物质与体系中其他外加反应物之间发生氧化还原反应，产生不稳定的激发态物质，由激发态回到基态以光的形式释放能[1]量，从而产生化学发光现象。早在1929年，Harvey在电解碱性鲁米诺水溶液时[2]发现了化学发光现象，由此揭开了ECL研究的序幕。但是，一开始由于条件的限制，导致有关ECL的研究进展很缓慢。进入20世纪80年代，ECL研究力度不断加强，范围不断扩展，ECL也随着广泛的应用于分析领域，形成了电致化学发光分析技术。电致化学发光免疫法有着较高的灵敏度和特异性，且所需设备简单，适用范围较广，在临床上的应用较为广泛。有大量临床研究认为，电致化学发光免疫法在肿瘤生物标志物检测中有着较好的应用效果，有助于恶性肿瘤的早期筛查、诊断、临床治疗评估与预后。到目前为止，研究较为成熟且应用最多的电致[3]化学发光体系主要有：钌的配合物及其衍生物类；鲁米诺（3-氨基苯二甲酰肼）[4][5]2−[6]及其衍生物类；光泽精及其衍生物类；O2/S2O8体系；以及CdSe、ZnS、CdTe[7]等量子点，金、银纳米簇，碳点，硅点等也具有电致化学发光性质并且应用得也越来越广泛。1.2发光纳米材料1.2.1发光纳米材料概述纳米材料是一种由基本颗粒组成的粉状或团块状天然或人工材料，这一基本颗粒的一个或多个三维尺寸在1nm至100nm之间，并且这一基本颗粒的总数量在整个材料的所有颗粒总数中占50％以上。当物质尺度小到一定程度时，则必须改用量子力学取代传统力学的观点来描述它的行为。纳米材料具有表面效应、量子效应及宏观量子隧道效应等特性，呈现出特殊的催化、电化学和光学特质，如大的比表面积、高的表面自由能、强的吸附能力、优越的电子传递能力以及良好的[8]生物兼容性等。随着科学技术的发展，为纳米技术的研究提供了多方支撑，使得纳米技术的研究工作广泛开展，近年来，随着纳米材料在电致化学发光领域的应用，我们将纳米材料划分为发光功能化纳米材料和自发光纳米材料。发光功能化纳米材料的制备，是指通过合理的表面化学设计，纳米材料表面1 西南大学硕士学位论[9]固载或在纳米材料内包夹电致化学发光试剂，使纳米材料具备发光活性。将这种新型功能化纳米材料作为纳米探针或用于组装纳米分析界面，利用该材料的特殊性能，可用于构建新型高灵敏生物传感器，且具有如下特点：（1）纳米材料具有大的比表面积。利用纳米材料作为载体，可固载更多的发光试剂作为信号探针，相比于单分子标记技术，可大大提高分析信号，从而提高分析灵敏度；（2）利用纳米材料的特殊催化和导电性能，增强分析信号，提高检测灵敏度；（3）基于纳米材料优异的生物相容性、小尺寸效应和易于组装的性能，将其与生物分子（如DNA、适配体、抗体、小分子等）进行组装，可制备生物分析探针或构建纳米分析界面。随着纳米材料迅速的发展，自发光纳米材料，即本身具备电致化学发光活性的纳米材料，如量子点（QDs）、碳点（CDs）和金属簇（NCs），受到人们的广泛关注。其中，贵金属纳米簇近年来在纳米科技许多领域中逐渐成为一种广泛应用的纳米材料。它是由Au，Ag，Pt等贵金属元素组成的分子聚集体，一般由几个到几十个原子组成，核簇直径通常小于2nm，尺寸及性质均介于单个原子和纳米粒[10]子之间纳米簇的尺寸接近于传导电子的费米波长，因此其光学性质、化学性质、电学性质与单个原子和大的纳米颗粒相比都表现出了明显的不同。更重要的是，由于量子限域效应的存在，使纳米簇展现了优异的光学性能。1.2.2功能化发光纳米材料在电致化学发光免疫传感器领域的应用2+西南大学袁若小组通过Ru(dcbpy)3和羧基化二氧化硅纳米粒子之间的酰胺化反应合成自增强电化学发光的钌-二氧化硅复合粒子，分子内反应缩短了能量传递过程，减少能量损失实现MDA-MB-231乳腺癌细胞的灵敏、快速、低成本的[11]检测。图1.1Ru−N−SiNPs标记膜联蛋白和电致化学发光传感器的原理图。Fig.1.1SchematicdiagramsofRu−N−SiNPslabeledannexinVandECLcytosensor.西南大学袁若小组首先采用三嵌段共聚物胶束芯-壳-芯结构作为模板，制备中2 第一章绪言空的、有磁性氧化锰纳米晶体（H-Mn3O4）。然后，聚乙烯亚胺（PEI）和铂纳米颗2+粒和Ru(dcbpy)3被固载在H-Mn3O4纳米粒子上，形成H-Mn3O-PEI-PtNPs纳米复2+合材料，其中PEI作为共反应试剂能有效提升Ru(dcbpy)3的ECL发光效率和PtNPs作为纳米通道可以大大加快了电子转移。最后，由于之间的协调铕和羧基，获得的H-Mn3O4-PEI-PtNPs局部聚集成为片状纳米结构3+（H-Mn3O4–PEI–PtNPs–Ru)n–Eu），通过该功能化发光纳米材料促使ECL发光效-1[12]率进一步提高。传感器对细胞周期蛋白A2的检出限低至0.3pgmL。3+图1.2(A)H–Mn3O4和(H–Mn3O4–PEI–PtNPs–Ru)n–Eu的制备过程，(B)电致化学发光传感器的制备和信号放大机理。3+Fig.1.2(A)ThepreparationofH–Mn3O4and(H–Mn3O4–PEI–PtNPs–Ru)n–Eu;(B)thepreparationandamplificationmechanismofECLbiosensor.1.2.3自发光纳米材料在电致化学发光免疫传感器领域的应用南京大学朱俊杰小组首次报道了以牛血清白蛋白（BSA）为稳定剂制备的金纳米团簇（AuNCs）具有显著的ECL发光。并在文章中阐述了可能的ECL发光机理是从氧化铟锡电极（ITO）与AuNCs的导带之间发生了有效的电子转移。然后以AuNCs为ECL探针采用简单的无标记方法检测多巴胺。该AuNCs具有良好水溶性，低毒性，易于标记，和优异稳定性，可以作为未来ECL生物传感器的新类[13]型发光试剂。3 西南大学硕士学位论图1.3(a)ITO和AuNCs之间的电子转移和(b)AuNCs的ECL机理。Fig.1.3Schematicillustrationof(a)electrontransferbetweenITOandAuNCsand(b)theECLmechanismsofAuNCs.西南大学袁若小组利用富含胞嘧啶（C-rich）的环状模板作为银离子的配体，在0~-1.35V的电压下原位电还原产生银纳米团簇（AgNCs）作为信号探针，以新型靶循环同步滚环扩增（RCA）为信号放大策略构建了简易ECL生物传感器，-1[14]并实现了miRNA的超灵敏检测，检出限低至22amolmL。图1.4(A)目标物循环同步RCA和原位生成AgNCs的原理，(B)制备循环模板，(C)基于2−AgNCs/S2O8ECL体系的发光原理。Fig.1.4Schematicllustrationof(A)theprincipleoftarget-cyclingsynchronizedRCAandinsituelectrochemicalgenerationofAgNCs,(B)preparationofthecirculartemplate,and(C)ECL2−mechanismofAgNCs/S2O8-basedECLsystem.1.3生物传感器简介国际理论与应用联合化学会（IUPAC）对生物传感器（biosensor）的最新定义为：“通过利用一种能与换能元件在空间上直接接触的生物识别元件提供特殊的定[15]量或半定量的分析信息的完整的综合装置”。因此，生物传感器主要由生物敏感膜和换能器两部分构成。生物传感器是以固定化的生物成分（RNA、DNA、抗4 第一章绪言体、抗原、酶、生物膜等）或生物体本身（细胞、微生物、组织等）为敏感材料，作为分子识别元件，在复杂体系中起到选择性(或称特异性)结合待测物的作用，与[16]适当的化学换能器相结合产生的一种快速检测各种物理、化学和生物量的器件。它通过各种物理、化学换能器监测目标物与敏感材料之间的反应进程，然后，将反应的程度转变成电或光信号，根据信号值实现定量检测。基于此，敏感材料是对目标物进行选择性作用的生物活性单元。电致化学发光活性试剂是以物理方法（包埋、吸附等），或是以化学方法（交联、聚合等）被固载纳米材料上，然后，以电极作为换能器测定电致化学发光反应产生的光信号，从而间接地测定目标物[17]的浓度。生物传感器是一个典型的多学科交叉产物，包含了分析化学、医学、材料学、物理学和电子技术等，能对所需检测的生物物质进行快速、灵敏的分析和追踪，在科学研究、工业生产、疾病检测中具有重要的作用。从1967年S.J.乌普迪克等制[18]出了葡萄糖传感器（第一个生物传感器）开始，伴随着分子生物技术与光电子技术、微细加工技术和纳米化学技术等新技术的结合，加之生物传感器本身具有灵敏度高、选择性好、设备简单、成本低廉、检测耗时少和操作简便等优点，已跻身于分析生物技术的重要领域。在临床医学中，快速准确检测血糖浓度已经得以实现，Asif等设计以功能化氧化锌纳米棒为基础的电化学葡萄糖传感器能够测量[19]人脂质细胞内葡萄糖，时间仅需1s，测得的葡萄糖浓度值范围比传统方法宽。免疫传感器生物传感器可准确快速检测血液、体液中的肿瘤生物标记物，为患者[20]有效治疗和康复提供保证。在军事医学中，生物传感器被视为新一代毒剂检测器的主要研究方向。目前，研究和使用最多的乙酰胆碱脂酶传感器。生物传感器[21]的专一、灵敏、响应快的特点对生化试剂的侦检方面具有独特的优势。。在微生物发酵过程中，检测多种有关的生化参数（生物量、细胞活性、底物营养、产物代谢物），是生物技术领域研究者和工程师们有效地对过程进行控制的必要前提[22]。在环境监测中，众多大气主要污染物中，SO2是引发酸雨形成的主要原因。Martya等人将亚细胞类脂类——含亚硫酸盐氧化酶的肝微粒体固定在醋酸纤维膜[23]上，和氧电极制成安培型生物传感器，可对酸雨样品溶液进行定量检测。1.4电致化学发光免疫传感器概述电致化学发光免疫传感器是一种将电致化学发光分析方法与高特异性的免疫学分析方法相结合而发展起来的分析方法，兼具高选择性、高灵敏度以及稳定性的优点。电致化学发光免疫传感器通过固定化技术将免疫蛋白结合到电极表面，当抗体分子超变区与抗原决定簇发生特异的免疫识别反应后，生成的免疫复合物5 西南大学硕士学位论与产生的电致化学发光信号相关联，由换能器转化这些与待测分析物浓度(或活度)[24]相关的信号。再通过二次仪表放大输出，从而实现对待测免疫分子的定量检测。同其他的免疫传感器检测方法一样，电致化学发光免疫传感器的检测方法通常有直接法和夹心免疫法。夹心法，首先也是将抗体固定在修饰电极表面，接着与对应的待测抗原反应，再与被特殊标记（电致化学发光活性试剂或参与酶、纳米材料或者其他电致化学发光的物质）的二抗形成抗体-抗原-被标记抗体的免疫复合物夹心反应模式，引起传感器ECL信号的变化，通过ECL信号的变化测得待测抗原[25,26]的浓度。80年代以后，基于有机化合物、无机化合物以及半导体纳米材料构建的新型电致化学传感器被广泛的发展。寻找新颖的高发光效率电致化学发光试剂或采用物理或化学方法将发光活性分子修饰在纳米材料上成为合成并研究这些新型发光试剂的源动力。近年来，信号放大型的电致化学发光免疫传感器研究极大的满足了对癌症等恶性疾病标志物的免疫分子快速、灵敏检测要求。随着生物分子技术和纳米材料合成技术的日新月异，利用化学、纳米材料及酶等多种转化并放大与免疫反应有关的检测信号，成为电致化学发光免疫传感器的重要研究方向。联吡啶钌及其衍生物的电致化学发光免疫分析体系是第一个用于商业应用，也是目前商业上使用最广泛的电致化学发光免疫分析体系。联吡啶钌的结构易于功能化，可以很方便对其进行衍生化处理，进一步与蛋白质分子相结合。且联吡啶钌发光体系具有化学稳定性好、电化学行为可逆、可以实现重复激发、多元分析及全自动化等突出优点。因此，以联吡啶钌类化合物在电致化学发光免疫分析中具有广泛的应用前景。商业上基于该体系的典型的电致化学发光免疫分析为瑞士罗氏(Roche)公司研发的ELECSYS1010和ELECSYS2010型全自动电化学发光生物分析系统。图1.5电致化学发光免疫传感器制备原理图。Fig.1.5SchematicdiagramoftheprinciplefortheECLimmunosensor.1.5心肌肌钙蛋白简介急性心肌梗塞（AMI）是冠状动脉急性、持久而严重的心肌缺血所致的部分新积极性坏死，临床上表现为心律失常、休克或心力衰竭，常危及患者生命。近6 第一章绪言年来心肌梗塞发病率呈明显上升趋势，在我国每年约有300万人发生心肌梗死。正确诊断及时救治对挽救濒死心肌对改善预后降低急性期病死率和死亡率具有重[27]要意义。理想的心肌梗塞标志物必须具备一下几点特征：1、标志物只存在心肌组织内，有强度心脏专一性。2、心肌受损后很快增高，标志物在血液内能迅速上升（在1~3h内）超过正常值，达到化验的灵敏度。3、标志物在血液中能够维持[28]足够时间（1h到十几天），即使病人延迟入院也有机会接受治疗。心肌肌钙蛋白（cardiactroponin，cTn）是，位于心肌收缩蛋白的细肌丝上的调节心肌肌肉收缩蛋白。肌钙蛋白的作用之一是把原肌凝蛋白附着于肌动蛋白上，三者共同组成细肌丝。通过三种不同基因的亚基组成分为：心肌肌钙蛋白T（cTnT）、[29]心肌肌钙蛋白I（cTnI）和肌钙蛋白C（cTnC）。cTnI为三磷酸腺苷酶的抑制性亚单位，分别定位于骨骼肌快肌，慢肌和心肌中，其中cTnI在基因上有着独特的氨基酸序列，少量以游离形式存在于细胞胞浆，大部分以结合形式存在于肌原纤维上。心脏损伤早期，心肌细胞未坏死，但细胞膜破坏，游离形式的cTnI进入组织间隙，经淋巴回流入血。血清cTnI于6h升高，其后肌原纤维不断崩解破坏，[30]固定形式的cTnI不断释放，血清水平于18-24h达高峰，10天后降至正常。[31][32]已经报道的检测cTnI的方法有酶联免疫法、酶联荧光分析法（ELFA法）、[33][34][35]光磁生物传感器、酶标电泳法和电化学免疫分析法等。在患病的早期阶段，高效、低浓度、快速的检测出心肌肌钙蛋白-I是非常必要的，电致化学发光免疫传感器是将免疫传感器与电致化学发光（ECL）技术结合而发展起来的具有高选择性、[36,37]高灵敏度、低背景等优点的生物传感器。近年的工作中，将ECL免疫传感器结合发光功能化纳米材料特有的优点对发展高灵敏检测心肌肌钙蛋白-I起到重要的理论意义和实际的应用价值。1.6本文研究思路本文将发光纳米复合材料引入电致化学发光免疫传感器，在传感器的构建，电致化学发光试剂的发光机理，电致化学发光信号的增强，选择性等性能的提高，和cTnI的检测范围、检出限等方面进行了以下几点探讨和研究：2+（1）本工作基于自增强电致化学发光探针（L-Cys@Ru(dcbpy)3），即将共反应试剂和发光基团连接在一个分子上，设计了无加入试剂的ECL免疫传感器用于高灵敏检测cTnI。该方法避免了加入任何共反应试剂在检测底液中来放大信号，因此简化了实验操作。同时，由于分子内ECL反应缩短了电子传递路径，减少了能量损失，目标传感器展现了优秀的分析性能检测cTnI，线性范围从0.25pg/mL到0.1ng/mL，相较于已报道的ECL免疫检测检出限降低了一个数量级。此外，它7 西南大学硕士学位论可作为一个有潜力的分析方法检测大量蛋白分析物。（2）本工作基于鲁米诺-Pt@AuNFs纳米复合物设计了一个新颖多面的ECL平台用于超灵敏的检测cTnI。其中，鲁米诺连接Pt@AuNFs形成新颖的纳米复合物，提供了一个大的比表面积固载了大量的Ab2和ChOx(Ab2/luminol-Pt@AuNFs/ChOx)。鲁米诺的ECL反应包括催化ChOx原位生成H2O2和H2O2被Pt@AuNFs模拟酶分解，直接催化鲁米诺的ECL信号。我们可以检测cTnI低于费摩级别，并且预期该方法可以扩展探测多种分析物分子。（3）本工作中，并首次报道了AgNCs在458nm波长有显著的阴极ECL发光，并简单、快速的通过在高氯酸锂-甘氨酸缓冲液保护中电还原银离子合成AgNCs。相较于传统在溶液中的纳米簇，我们制备的AgNCs被直接电沉积在电极上作为一2+种有效稳定的电致化学发光供体。随后，AgNCs和Ru(bpy)3之间发生高效的电致化学发光能量转移，继而产生更强的阴极ECL信号，从而达到cTnI的灵敏检测。通过计算ECL650nm/ECL458nm比例来检测cTnI的浓度，在1.0ng/mL到1.0pg/mL范围内，ECL650nm/ECL458nm的对数值和cTnI浓度的对数值呈现良好的线性关系，检出限为0.33pg/mL。我们ECL-RET体系构建了一种新颖的途径来增强发光AgNCs，以拓宽AgNCs的分析应用。8 第二章基于自增强Ru(II)复合物的超灵敏电致化学发光传感器用于检测心肌肌钙蛋白I第二章基于自增强Ru(II)复合物的超灵敏电致化学发光免疫传感器用于检测心肌肌钙蛋白I2.1引言近年来，急性心肌梗塞（AMI）被列为心血管疾病发病率和死亡率的主要原因。大量临床研究证明cTnI只存在AMI患者的心肌组织内，出众的心脏病特异性[38,39]和选择性，它被认为是检测AMI的最佳心脏病标记物。因此，在患病的早期阶段，高效、低浓度、快速的检测出cTnI对改善和降低AMI患病率和死亡率具有重要意义。迄今为止，检测cTnI主要依靠基于各种检测技术的标记免疫夹心法，[40][41][42]例如，酶联免疫测定（ELISA），光磁生物传感器，电化学免疫检测法。但是，由于这些方法有步骤复杂、耗费时间、破坏环境等缺点，所以依旧要求提高检测技术水平。电致化学发光（ECL）免疫传感器由于高灵敏、低背景和宽动态范围等优点引起了广泛关注和重视。2+在许多ECL发光试剂中，三联吡啶钌(Ru(bpy)3)及其衍生物有高量子收益率，[43]高激发态寿命和强发光，其作为一种被广泛研究的ECL发光试剂。最近，为了2+2+提高Ru(bpy)3的发光强度，大量的研究在寻找合适的Ru(bpy)3共反应试剂，例[44][45][46]如过二硫酸盐，草酸盐，或是三丙胺。但是，检测溶液中众多微观的环境2+因素，例如黏度，温度，表面活性，离子强度和pH易影响水相中Ru(bpy)3的ECL[47]强度。为了解决这些问题，我们将共反应试剂和发光试剂连接在一个分子上，并固载在电极表面来构建无试剂ECL传感器。这类的无试剂ECL传感器可以避免在分析步骤中加入共反应试剂，是一种减少试剂消耗和简化反应步骤的可行性方[48]法。在我们先前的工作中，我们通过连接共反应试剂（poly-L-lysine）来增强2+[49]2+Ru(bpy)3发光强度并成功构建了无试剂ECL传感器。该工作增强了Ru(bpy)3发光强度，但实验操作复杂。最近Swanicketal.设计了一个Iridium(III)的自增强电致化学发光复合物，将共反应试剂和发光试剂交联在一个小分子上极大的简化了[50]ECL检测途径和显著增强了检测灵敏度，但该自增强复合物还未应用在传感器。2+据报道多种氨基复合物可以作为共反应试剂来显著增强Ru(bpy)3发光强度[51]。线状的L-cysteine（L-Cys）具有两个亚甲基的分子结构上连接了一个氨基和2+一个羧基。综上所述，L-Cys不仅可作为一个合适的共反应试剂，也是Ru(dcbpy)32+的连接试剂。在我们的工作中，我们将共反应试剂L-Cys和Ru(dcbpy)3连接合成了新颖的自增强电致化学发光Ru(II)复合物。经过试验证实，由于分子内ECL反应相较于分子间反应缩短了电子传递路径，减少能量损失，促使Ru(II)复合物的9 西南大学硕士学位论ECL效率显著增强。随着纳米技术不断进步，金纳米材料因为其独特的光学效应、生物偶联和无毒性等潜在的优点，得到了研究者的广泛兴趣并得以应用在生物技术体系的诊断[52]应用和生物成像上。金纳米棒（AuNRs），这种细长的纳米粒子相较于球状的纳米粒子有大的比表面积的优势，使AuNRs被广泛应用在化学和生物化学传感器中。基于以上优点，在这个工作中，我们基于新颖的Ru(II)复合物作为ECL信号探针构建无试剂ECL免疫传感器。传感界面通过cTnI抗体（anti-cTnI）组装在电沉积树枝状纳米金（GNDs）修饰的电极上。通过Au–N键或Au–S键连接钌(II)复合物和anti-cTnI（Ab2）在AuNRs上实现免疫夹心传感器形式（Ab2/AuNRs/2+L-Cys@Ru(dcbpy)3）。这个策略避免在检测溶液中加入共反应试剂，显著简化了2+免疫测定过程，缩短了分析时间，显著增加了Ru(dcbpy)3的ECL效率，提供了一个有前景的平台用于临床免疫测定。2.2实验部分2.2.1试剂和仪器2+三(4,4’-二羧酸-2,2’-联吡啶)钌(II)二氯化物（Ru(dcbpy)3）、氯金酸（HAuCl4·4H2O）和牛血清蛋白（96–99%）购买自Sigma公司（美国）。L-半胱氨酸，抗坏血酸（AA），十六烷基三甲基溴化铵（CTAB），硝酸银，硼氢化钠购买自成都科龙化学公司（中国，成都）。人心肌肌钙蛋白抗原（cTnI）和cTnI鼠单克隆抗体（anti-cTnI）购买自上海华裔公司（纯度高于95%）（中国，上海）。磷酸缓-1-1-1冲溶液（pH7.4），含有0.1molLNa2HPO4，0.1molLKH2PO4和0.1molLKCl，-1-1并用0.01molL的HCL或0.01molL的NaOH调至pH=7.4。所有溶液使用前均o保存在4C下。其他试剂均为分析纯试剂。实验用水均为二次去离子水。ECL发光由传统的MPI-A型电致化学发光分析仪检测（西安瑞迈仪器公司）。在ECL发光实验中采用三电极体系：被修饰的玻碳电极（GCE,Ф=4mm）为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极。循环伏安法（CV）由CHI610A型电化学工作站（上海辰华仪器公司）测量。所有测试均采用三电极系统，玻碳电极为工作电极，甘汞电极为参比电极，铂丝电极作为对电极。不同纳米材料的形貌特征由透射电镜（TEM，H600，日本日立公司），和扫描电镜（SEM，S-4800，日本日立公司）表征。紫外吸收光谱由UV-2550分光光度计测量（岛津公司，日本）。10 第二章基于自增强Ru(II)复合物的超灵敏电致化学发光传感器用于检测心肌肌钙蛋白I2.2.2制备金纳米棒[53]金纳米棒（AuNRs）按照之前报道过的晶种生长法合成。简而言之，混合5-1-1mL的（0.2molL）CTAB和0.5mL的（5mmolL）HAuCl4制成种子溶液。然-1后，取10mmolL新配制的NaBH4溶液快速加入到0.6mL种子溶液中。剧烈搅拌下溶液颜色由深黄变成了褐色。静置2h后，种子溶液被用于合成AuNRs。-1将40mL的（0.2M）CTAB和5mL的（10mmolL）HAuCl4缓慢加入0.25-1-1mL的（10mmolL）硝酸银溶液中。温和搅拌后，取0.27mL的（100mmolL）oAA和0.42mL的种子溶液加入混合溶液中，然后溶液在30C下静置24h。最后，制备好的AuNRs溶液离心洗涤三次以上，所得产物分散在5mL的二次去离子水中。2+2.2.3制备自增强L-Cys@Ru(dcbpy)3分子化合物2+L-Cys@Ru(dcbpy)3分子化合物完整制备过程系统地呈现在图2.1中。如图所示，将97mgL-Cys分散在4mL的（1%）醋酸中，连续超声获得均匀的悬浮液。2+同时，在激烈的搅拌下，将4.5mgRu(dcbpy)3溶解在含有400mgEDC和100mg2+NHS的1mLPBS（pH7.4）中，以活化Ru(dcbpy)3的羧基。然后在上述溶液中加-12+入1mL（20mmolL）L-Cys，经8h的反应L-Cys的氨基和Ru(dcbpy)3的羧基2+之间形成肽键。最后，未反应的L-Cys和Ru(dcbpy)3在二次去离子水中透析分离2+（分子量小于8500），便制成了新颖的Ru(II)衍生物（L-Cys@Ru(dcbpy)3）。2+图2.1L-Cys@Ru(dcbpy)3分子化合物制备图。2+Fig.2.1AschematicdiagramoftheprocedureusedtoprepareL-Cys@Ru(dcbpy)3molecularcompounds.2+2.2.4制备anti-cTnI/AuNRs/L-Cys@Ru(dcbpy)3探针（Ab2生物复合物）2+将1mLL-Cys@Ru(dcbpy)3复合物和100μLanti-cTnI溶液同时加入到1mLo制备好的AuNRs溶液中，然后在4C下持续搅拌8h，AuNRs，anti-cTnI和Ru(II)衍生物之间生成Au–N键或Au–S键。随后，加入200μL牛血清蛋白（BSA,w/w,11 西南大学硕士学位论1%）孵育40min封闭AuNRs表面未修饰的位点。最后，通过离心得到产物2+anti-cTnI/AuNRs/L-Cys@Ru(dcbpy)3（Ab2生物复合物），并分散于1mLPBS(pHo7.4)中后储存于4C下备用。图2.2(B)显示Ab2生物复合物的图解。2.2.5免疫传感器的制备在修饰前，玻碳电极用0.3,0.05µm的Al2O3粉抛光并用蒸馏水冲洗干净，接着分别在蒸馏水、无水乙醇、蒸馏水中超声清洗，清洗后的电极置于室温下自然-1-1晾干备用。将修饰好的电极浸没在含有2.5mmolLHAuCl4和0.5molLH2SO4-1的150mmolL乙二胺溶液中，以0.0V的恒定电位电化学沉积600s，在电极表面[54]上构建树枝状纳米金层（GNDs），自然晾干树枝状纳米金层修饰的玻碳电极o（GNDs/GCE）。然后，将该修饰电极浸入0.5mg/mL的anti-cTnI(Abl)溶液中并4C孵育4h，通过基底的羧基和抗体分子上的氨基之间的酰胺化反应将抗体分子组装至电极表面（anti-cTnI/GNDs/GCE）。最后，用1%的BSA溶液封闭GNDs纳米粒子上多余的结合位点（BSA/anti-cTnI/GNDs/GCE）。将得到的修饰电极，不使用时保存在冰箱内。图2.2免疫传感器构建示意图和信号放大机理。(A)插图中显示了AuNRs的制备过程，(B)逐2+步展示了anti-cTnI/AuNRs/L-Cys@Ru(dcbpy)3探针的制备过程，(C)比较了自增强L-Cys@Ru(II)复合物和单独Ru(II)的电致化学发光信号。Fig.2.2Theschematicdiagramsoftheimmunosensorandsignalamplificationmechanism.Theinsertof(A)shownthediagramofpreparationofAuNRs,(B)revealedthestepwiseof2+anti-cTnI/AuNRs/L-Cys@Ru(dcbpy)3probefabrication,(C)shownthecomparativeECLsignalswithself-enhancedL-Cys@Ru(II)compoundsandwithRu(II)alone.2.2.6测量方法12 第二章基于自增强Ru(II)复合物的超灵敏电致化学发光传感器用于检测心肌肌钙蛋白I在检测之前，将免疫传感器在常温条件下浸于不同浓度的cTnI溶液中40min，根据抗原抗体的特异性反应使得免疫复合物层修饰到电极表面（cTnI/BSA/anti-cTnI/GNDs/GCE）。最后，将该修饰有目标抗原的传感器与二抗复合物探针孵育40min，它通过免疫反应结合到电极表面。至此，目标传感器制备成功。免疫传感器的每一步修饰后都用磷酸盐缓冲溶液（pH7.4）冲洗。采用MPI-E型ECL分析系统对所修饰电极的ECL性能进行研究，测试底液为3mL的0.1mol-1L磷盐缓冲溶液（pH7.4）中。检测过程中，光电倍增管的电压：800V，应用电压：0.2~1.25V(vs.Ag/AgCl)，扫描速率为100mV/s。随着抗原cTnI浓度增加，2+2+二抗复合物（anti-cTnI/AuNRs/L-Cys@Ru(dcbpy)3）浓度也增大，Ru(dcbpy)3的ECL信号随之增加。因此，ECL强度的变化直接反应了cTnI浓度的变化。2.3结果与讨论2.3.1不同纳米材料的表征合成纳米材料的大小和形貌特征由透射电子显微镜（TEM）表征。AuNRs的TEM图显示在图2.3a，AuNRs均匀分散并展现了典型的管状结构。纳米管的尺寸长度为30nm直径为9nm，纵横比为3.3。为了检测AuNRs的均一性，采用紫外吸收（UV-vis）光谱表征AuNRs的分散情况。AuNRs的UV-vis光谱表现出两个不同的等离子体吸收峰集中在476和746nm(图2.3b)，它们分别归因于AuNRs的[55]横向和纵向等离子体共振吸收，表明我们成功合成了AuNRs。图2.3c显示GNDs被直接沉积在电极表面的SEM图，证实GNDs展现了明确的树枝结构，图2.3c的插图显示了部分放大的GNDs的SEM图。图2.3AuNRs的(a)TEM图和(b)紫外吸收图。(c)GNDs的SEM图Fig.2.3(a)ATEMmicrographofAuNRs.(b)AbsorptionspectraofthecolloidalAuNRs.(c)ShowedapartiallyenlargedSEMimageoftheGNDs.13 西南大学硕士学位论2.3.2L-Cys@Ru(II)复合物的稳定性2+UV-vis光谱被应用于检测L-Cys@Ru(II)复合物的稳定性。Ru(dcbpy)3表现出两个不同的等离子体吸收峰集中在299和465nm(图2.4)。由于在L-Cys的氨基和2+Ru(dcbpy)3的羧基之间生成肽键，L-Cys@Ru(II)复合物吸收峰分别红移至335nm[56][57]和510nm。L-Cys的羧基在212nm有一个的等离子体吸收峰，但L-Cys@Ru(II)复合物在200nm附近没有吸收峰，证明了羧基的结合。这些变化证明了L-Cys@Ru(II)复合物被成功合成。图2.4L-Cys(曲线a),L-Cys@Ru(II)complex(曲线b)，和Ru(II)(曲线c)的紫外吸收图。Fig.2.4UV-visabsorptionspectrumofL-Cys(greenline),L-Cys@Ru(II)complex(redline),andRu(II)(blueline).2.3.3L-Cys@Ru(II)复合物的可能发光机理图2.5A显示了L-Cys@Ru(II)复合物修饰的电极在饱和氧气的PBS（pH7.4）底液中的ECL和电化学性能。首先当电压从+0.2V负扫描至+1.0V，并未产生ECL信号。当电压高至1.0V,L-Cys@Ru(II)复合物被氧化为L-Cys@Ru(III)，产生显著的ECL信号（峰值强度：2633a.u，图2.5B，红色曲线），表明L-Cys@Ru(II)*2+跃迁产生ECL信号。相较于L-Cys@Ru(III)的ECL信号，Ru(dcbpy)3/GCE在包含L-Cys作为共反应试剂的PBS底液中检测，产生低的ECL信号（337a.u）。其2+中的绿色曲线表示了Ru(dcbpy)3/GCE在单纯的PBS底液中检测的ECL信号（1322+a.u），信号降低证明L-Cys可以作为共反应试剂增强Ru(dcbpy)3的ECL信号。此外，裸电极在包含L-Cys的PBS底液中检测，由于体系中缺少发光试剂没有产生ECL信号（粉色曲线）。综上所述，自增强L-Cys@Ru(II)复合物可以产生最强的发光强度。14 第二章基于自增强Ru(II)复合物的超灵敏电致化学发光传感器用于检测心肌肌钙蛋白I图2.5(A)L-Cys@Ru(II)复合物修饰电极的CV和相应的ECL曲线。(B)不同修饰电极的ECL响应对比。电极扫描速率：100mV/s。Fig.2.5(A)CV(greenline)anditscorrespondingECLcurves(redline)ofL-Cys@Ru(II)2+compoundsmodifiedGCE.(B)ECLcurvesofL-Cys@Ru(II)/GCE(red)inPBS;Ru(dcbpy)3/GCEwith(blue)andwithout(green)L-CysinPBS.ThepinkcurveshowedthebareGCEinthePBScontainingL-Cys.Scanrate:100mV/s.我们基于普遍的氨氧化机制推测自增强L-Cys@Ru(II)复合物的ECL机理，如下述方程：2.3.4ECL免疫传感器的电化学表征图2.6免疫传感器修饰过程的循环伏安表征。-1Fig.2.6CVsofdifferentmodifiedelectrodesatPBScontaining5.0mmolLK3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6](1:1)asredoxprobe:(a)bareGCE,(b)GNDs/GCE,(c)anti-cTnI/GNDs/GCE,(d)BSA/anti-cTnI/GNDs/GCE,(e)cTnI/BSA/anti-cTnI/GNDs/GCE.ScanningofCVswasfrom-0.2to0.6Vwitharateof100mV/sandallpotentialsaregivenagainstSCE.我们以铁氰化钾溶液作为氧化还原标记物，采用循环伏安法（CV）来表征ECL免疫传感器每一步构建过程。相应的CV曲线如图2.6所示，当在裸电极上沉积15 西南大学硕士学位论GNDs后，由于Au优异的导电性，其氧化还原峰（曲线b）相较于裸的玻碳电极（曲线a）有明显增强。当电极进一步孵育anti-cTnI后，由于抗体生物大分子阻碍电子的传递使得氧化还原峰明显有所下降（曲线c）。然后依次用BSA封闭非特异性结合位点（曲线d）和孵育cTnI抗原（曲线e）后，BSA以及抗原-抗体免疫复合物对电子传递的阻碍作用，CV曲线也依次进一步降低。2.3.5Ab2生物结合物孵育时间的优化合适的Ab2生物结合物孵育时间是形成稳定的免疫夹心传感器的重要因素。2+Ab2生物结合物（anti-cTnI/AuNRs/L-Cys@Ru(dcbpy)3）是一个复杂的混合物，包含了发光试剂和共反应试剂。所以抗原抗体的特异性结合是得到稳定的ECL信号和检测抗体的重要条件。如图2.7所示，随着孵育时间的增加，ECL信号逐渐增大，并在60min后趋于稳定。实践结果表明在70min时，Ab2生物结合物形成了稳定的免疫复合物，有效的增大了ECL信号。因此，70min作为最优孵育时间用于下一步研究。图2.7Ab2生物结合物孵育时间的优化。Fig.2.7OptimizationofincubationtimeforAb2bioconjugates.2.3.6放大策略的ECL表征为了证实AuNRs和L-Cys的放大策略，我们制备了三种Ab2功能化探针，如图2.8所示，绿色曲线代表了BSA/anti-cTnI/GNDs/GCE探针的ECL信号，红色曲线代表了孵育了0.005ng/mLcTnI和不同Ab2功能化探针的免疫传感器的ECL信2+号。Ab2功能化探针为：(a)anti-cTnI/AuNRs/Ru(dcbpy)3,(b)anti-cTnI/nano-Au/2+2+L-Cys@Ru(dcbpy)3，和(c)anti-cTnI/AuNRs/L-Cys@Ru(dcbpy)3（目标探针）。16 第二章基于自增强Ru(II)复合物的超灵敏电致化学发光传感器用于检测心肌肌钙蛋白I图2.8免疫传感器与不同的二抗复合物反应的ECL示意图。Fig.2.8ECLprofilesofthedifferentsandwichformatimmunosensorsintheabsence(a,greenline)andinthepresenceofAb2bioconjugates(b,redline),byusingvariouslabels:(A)anti-cTnI/AuNRs/2+2+Ru(dcbpy)3labeledimmunosensor,(B)anti-cTnI/nano-Au/L-Cys@Ru(dcbpy)3labeledimmune-2+sensor,and(C)anti-cTnI/AuNRs/L-Cys@Ru(dcbpy)3labeledimmunosensor.Theconcentrationof-1cTnIwas0.005ng/mL.Workingsolution:PBSorPBScontainingL-Cys(1mmolL).2+如图2.8所示，anti-cTnI/AuNRs/Ru(dcbpy)3修饰的免疫传感器产生137a.u信-1号值。然后加入L-Cys(1mmolL)在检测底液中产生了更高的信号值（大约3322+a.u），这证实了L-Cys可以作为合适的Ru(dcbpy)3共反应试剂。随后，金纳米颗粒（硼氢化钠还原HAuCl4合成nano-Au）取代了AuNRs构建探针b。探针b修饰的传感器产生751a.u的ECL信号值。最后，传感器修饰上目标探针产生2633a.u。2+显著的信号增强归因于：（1）L-Cys作为连接试剂有效的增强Ru(dcbpy)3的固载2+量，（2）AuNRs作为固载纳米粒子吸附了大量的Ru(dcbpy)3，（3）2+L-Cys@Ru(dcbpy)3复合物产生分子内ECL反应产生超高的发光效率。以上结果2+充分证实目标电极（anti-cTnI/AuNRs/L-Cys@Ru(dcbpy)3）有效的放大了ECL信号可以超灵敏检测cTnI。2.3.7免疫传感器对cTnI的ECL响应在最优的实验条件下，我们研究该传感器的性能。从图2.9所示，在0.25pg/mL到0.1ng/mL范围内，ECL信号强度随着cTnI浓度的增加而增加，检出限为0.0832pg/mL(S/N=3)。线性方程为y=7550.6+2088.5logc，线性回归率为R=0.9969。根据线性方程，该方法可以用于cTnI浓度的定量检测。同时，我们将目标电极和17 西南大学硕士学位论[38,39,58,59]先前的报道对照研究（表2.1），目标电极具备对cTnI优异的分析特性。[60]据报道，病人血液的cTnI浓度高于2.0ng/mL，心脑血管疾病的患病概率就极高。所以在临床诊断中，我们可以稀释血清进一步减少其他蛋的白质干扰，从而提供了一个高效、可靠的分析方法超低水平检测cTnI。图2.9免疫传感器在不同浓度cTnI的相应，插入图为线性斜率图。Fig.2.9ECLprofilesoftheimmunosensorinthepresenceofdifferentconcentrationsofcTnIbased-1onsandwichtypeformatinPBS(pH7.4,3.0mL)containing0.1molLKCl(a)~(h).TheconcentrationsofcTnI:(a)0.1ng/mL,(b)0.05ng/mL,(c)0.01ng/mL,(d)0.005ng/mL,(e)1pg/mL,(f)0.5pg/mL,(h)0.25pg/mL.表2.1不同cTnI检测方法检出限的比较Tab.2.1ComparisonofourresearchwithothermethodsforcTnIdetection.-1-1MeasurementprotocolLinearrange/(pg·mL)Detectionlimit/(pg·mL)ReferencesElectrochemical800~5000500Guoetal.Optomagneticbiosensor30~650030Dittmeretal.ELISA100~1000027Choetal.ECLIA2.5~100002Shenetal.ECL0.25~1000.083Presentwork2.3.8稳定性，重现性和选择性我们设计了对照试验来检测目标传感器的选择性和重现性（如图2.10A所示）。免疫球蛋白（IgG），氨基末端脑钠肽前体（BNP），和牛血清蛋白（BSA）被选为干扰物质来评估传感器的选择性。我们将0.1ng/mLIgG,0.1ng/mLBNP和0.1ng/mLBSA分别孵育在传感器上，传感器几乎没有ECL信号。然后传感器孵育上0.01ng/mLcTnI和不同的干扰物质，相较于仅孵育上0.01ng/mLcTnI的传感器，两者获得几乎相似的信号。以上结果说明目标传感器拥有好的选择性。随后，免疫传感器被连续扫描24个周期以研究其稳定性。如图2.10B所示，ECL信号强度2+没有出现显著的变化。优异的稳定性归因于AuNRs/L-Cys@Ru(dcbpy)3是一个好18 第二章基于自增强Ru(II)复合物的超灵敏电致化学发光传感器用于检测心肌肌钙蛋白I的载体固定了更多的anti-cTnI，这增加了抗原抗体特异性结合的概率，增加了传感器的检测灵敏度。同时，内部和相关性实验的相对标准偏差（ECL响应）用于评价免疫传感器的重现性。内部和相关性实验的相对标准偏差（R.S.D）都没有超过5%。图2.10免疫传感器的选择性示意图和稳定性。Fig.2.10(A)TheselectivityoftheproposedECLimmunosensorstowarddifferenttargets(a)Blank,(b)BSA(0.1ng/mL),(c)BNP(0.1ng/mL),(d)IgG(0.1ng/mL),(e)cTnI(0.01ng/mL)and(f)amixturecontainingBSA(0.1ng/mL),IgG(0.1ng/mL),BNP(0.1ng/mL)andcTnI(0.01ng/mL).(B)StabilityoftheproposedECLimmunosensorincubatedwith0.01ng/mLcTnIbasedonsandwich-1formatunderconsecutivecyclicpotentialscansfor24cyclesinPBS(pH7.4)containing0.1molLKCl.Scanrate,100mV/s.2.3.9实际样品检测此外，我们在人血清中采用标准加入法检测了免疫传感器的实用性。结果如表2.2所示，得到回收和相对标准偏差值从91.2%到107%，证实了该免疫传感器可以合理地应用于临床cTnI测定。表2.2实际样品检测Tab.2.2Preliminaryanalysisofrealsamples.-1-1SamplenumberAdded/(ng·mL)Found/(ng·mL)Recovery/%10.05000.052010420.04000.039097.530.03000.031510540.02500.024397.250.01000.010710760.005000.0045691.22.4结论2+综上所述，我们基于自增强电致化学发光L-Cys@Ru(dcbpy)3探针，即将共反应试剂和发光基团连接在一个分子上，成功地设计了无加入试剂的ECL免疫传感器用于高灵敏检测cTnI。该方法避免了加入共反应试剂在检测底液中来放大信号，简化了实验操作。同时，由于分子内ECL反应缩短了电子传递路径，减少了19 西南大学硕士学位论能量损失，目标传感器展现了优秀的分析性能检测cTnI，线性范围从0.25pg/mL到0.1ng/mL，相较于已报道的ECL免疫检测检出限降低了一个数量级。此外，它可作为一个有潜力的分析方法检测多种的蛋白分析物。20 第四章基于银纳晶和联吡啶钌的双波长比率法电致化学发光能量转移免疫传感器第三章基于胆碱氧化酶和鲁米诺还原的Pt@Au杂交纳米花的双重放大体系的超灵敏免疫分析3.1引言鲁米诺作为一种广泛研究的ECL发光试剂，具有低氧化电位、高发光效率和[60-62]强发光强度等优点。最近，众多课题组都在寻找合适的方式将鲁米诺固载在电极表面用于生物检测。郑兴旺课题组报道了一个由电氧化杂交聚合的鲁米诺-苯[63]胺纳米线复合物构建的固化鲁米诺传感器，用于检测葡萄糖。袁若课题组报道了基于Au-N或Au-S共价键连接的鲁米诺-金纳米粒子（luminol-AuNPs）复合物，[64]层层自组装构建的电极用于检测α-1-胎蛋白（AFP）。因此，为了提高传感器的灵敏度和稳定性固定鲁米诺是近年来的研究热点。[65]随着溶胶-凝胶合成技术的发展，双金属纳米材料相较于单独金属纳米材[66]料，有独特的电学、光学和催化性能，因此受到了广泛的关注。Pt@Au杂交纳米花（Pt@AuNFs），即Pt和Au杂交的花状纳米复合物被应用在这个体系中，其[67][68]具有对H2O2优异的催化性能和更大的比表面积。在溶胶-凝胶合成技术中多[69][70]种还原剂被应用,例如硼氢化钠，抗坏血酸等等。最近报道指出鲁米诺分子连[71]有芳胺基团，作为一种还原性复合物，其还原性可以用于制备金纳米粒子。在[72]还原反应进行的同时，鲁米诺通过Au-N或Au-S共价键和带负电的纳米材料和[73]带正电的氨基之间静电作用包裹在纳米材料的表面。基于以上优点，我们首次采用鲁米诺作为还原试剂合成鲁米诺-Pt@AuNFs来固载鲁米诺分子在电极表面。为提高鲁米诺的ECL发光强度，大量的工作是将H2O2加入检测底液中作为共··−反应试剂。随后，H2O2被进一步分解为OH和O2，它们催化了鲁米诺的信号放[74]大。尽管鲁米诺-H2O2体系有优异的ECL性能，H2O2仍有在检测溶液不稳定、[75-77]破坏生物分子的活性和无法被标记的缺点。为了进一步发展鲁米诺在ECL免疫传感器上的应用，基于拟酶信号放大的原位生成H2O2策略是一个极具潜力的研究方向。在先前的研究中，我们采用葡萄糖氧化酶（GOD）和辣根氧化酶（HRP）[78]设计了夹心免疫传感器用于构建拟酶信号放大体系有效地增强ECL发光强度，但这些体系有操作复杂和花费高等缺点。在这个工作中，我们选用了具有更高催[79]化效率的胆碱氧化酶（ChOx），并用鲁米诺-Pt@AuNFs纳米复合物代替了HRP作为纳米固载材料和模拟酶设计了拟酶双重放大体系。在鲁米诺-Pt@AuNFs纳米复合物的表面ChOx可以催化胆碱生成高浓度的H2O2，然后H2O2被Pt@AuNFs··−纳米复合物进一步催化分解为OH和O2促进鲁米诺的ECL发光强度。21 西南大学硕士学位论大量临床研究证明心肌肌钙蛋白I（cTnI）只存在急性心肌梗塞（AMI）患者的心肌组织内，具出众的心脏病特异性和选择性，它被认为是检测AMI的最佳心[80,81]脏病标记物。因此，在患病的早期阶段，高效、低浓度、快速的检测出cTnI对改善和降低AMI患病率和死亡率具有重要意义。我们采用鲁米诺-Pt@AuNFs纳米复合物作为信号探针，设计了拟酶双重放大ECL免疫传感器。如图3.1A所示，通过鲁米诺的还原性将发光基团连接在Pt@AuNFs纳米复合物上，随后通过Pt–N或Au–N共价键，鲁米诺-Pt@AuNFs纳米复合物固载了大量的anti-cTnI（Ab2）和ChOx。此外，鲁米诺的ECL反应包括催化ChOx原位生成H2O2和H2O2被Pt@AuNFs模拟酶催化分解（如图3.1B所示）。MnO2功能化的碳纳米管相较于单[82-84]纯的碳纳米管（MWNTs）展现了优秀的催化性能、大的比表面积和电性能，我们雇用该材料用于固载anti-cTnI修饰免疫传感界面。总之，目标抗原cTnI和二抗复合物（Ab2/luminol–Pt@AuNFs/ChOx）和anti-cTnI（Ab1）之间构成免疫夹心形式。3.2实验部分3.2.1试剂和仪器MWNTs（纯度>95%），KMnO4购买自成都有机化工有限公司（中国，成都）。L-半胱氨酸，抗坏血酸（AA），十六烷基三甲基溴化铵（CTAB），硼氢化钠（NaBH4）购买自成都科龙化学公司（中国，成都）。氯金酸（HAuCl4·4H2O），氯铂酸（H2PtCl6·6H2O）和牛血清蛋白（96–99%）（美国，Sigma公司）。Luminol（98%），胆碱氧化酶（ChOx）购买至郑州赛博生物技术研究所（中国，郑州）。MPI-E型电致化学发光分析系统（西安瑞迈分析仪器有限公司、中科院长春应化所），在检测过程中光电倍增高压为800V。循环伏安测试采用CHl610A型电化学工作站（上海辰华仪器公司），在实验中采用三电极体系：被修饰的玻碳电极为工作电极，甘汞电极为参比电极，铂丝电极为对电极。不同纳米复合物的形貌用的是扫描电子显微镜（S-4800，日本HitachiInstrmnent公司）表征，加速电压为20kV。X射线光电子能谱（XPS,ESCALAB.250英国V.G公司），用的是1486.6eV光源。3.2.2制备luminol-Pt@AuNFs纳米复合物-1参照晶种生长法，首先混合5mL的CTAB溶液（0.2molL）和100µL的-1HAuCl4溶液（1%），用新制的NaBH4（10mmolL）溶液还原后，在激烈的搅拌下溶液的颜色从棕色变成了深黄色，表明种子溶液制备成功。随后，1mL鲁米诺22 第四章基于银纳晶和联吡啶钌的双波长比率法电致化学发光能量转移免疫传感器-1原液，100µL的HAuCl4（1%）和50mL的CTAB溶液（0.2molL）混合，煮沸，并保持在沸腾的状况下30min，溶液的颜色逐渐变成深蓝色。继续保持搅拌，加入120µL的种子溶液以便获得金纳米花（luminol-AuNFs）。混合溶液静置20h以确保luminol-AuNFs生长完全。最后，通过离心三次以上得到产物luminol-AuNFs，并分散于2mLPBS中。-14mLluminol-AuNFs溶液中加入2mL的CTAB溶液(0.2molL)和1mL鲁米oo诺原液，加热至30C，再加入10µL的H2PtCl6(1%)。随后，溶液在30C的水浴中加热14h。最后，通过离心三次以上得到luminol-Pt@AuNFs杂交纳米花，并分o散于2mLPBS中后储存于4C下备用。3.2.3制备Ab2/luminol-Pt@AuNFs/ChOx纳米复合物Ab2/luminol-Pt@AuNFs/ChOx纳米复合物制备方法根据以下步骤（图3.1A）。首先，加入200µLcTnI抗体溶液，anti-cTnI通过Au–N键或Au–S键固载在纳米o复合物上。并在4C条件连续搅拌6h，随后加入1mL的ChOx（14U/mL）通过同样的方法固载在纳米复合物上以封闭纳米复合物表面未修饰的位点。最后，通过离心三次以上得到Ab2/luminol-Pt@AuNFs/ChOx纳米复合物，并分散于1mLoPBS中后储存于4C下备用。3.2.4合成MnO2@MWNTs纳米复合物[85]-1参照之前的文献报道，0.1gMWNTs均匀的分散在KMnO4(0.01molL)溶液中。随后，溶液在600W输出功率100kHz的超声中处理8h，KMnO4被还原成MnO2纳米粒子并嵌入在MWNTs中。最后，通过离心三次以上得到MnO2@MWNTso纳米复合物，并分散于4mL超纯水中储存于4C下备用。3.2.5免疫传感器的制备在修饰前，玻碳电极（GCE，Φ=4mm）用0.3,0.05µm的Al2O3粉抛光并用蒸馏水冲洗干净，接着分别在蒸馏水、无水乙醇、蒸馏水中超声清洗，清洗后的电极置于室温下自然晾干备用。免疫传感器的构建如图所示：首先，将上述制备的溶液超声分散均匀得到均一的MnO2@MWNTs纳米复合溶液。在预处理的GCE表面滴涂5µLMnO2@MWNTs纳米复合物，自然晾干得至MnO2@MWNTs修饰的玻碳电极（MnO2@MWNTs/GCE）。然后，将该修饰电极浸入0.5mg/mL的anti-cTnI（Abl）o溶液中并4C孵育4h，通过基底的羧基和抗体分子上的氨基之间的酰胺化反应将23 西南大学硕士学位论抗体分子牢牢的组装至电极表面（anti-cTnI/MnO2@MWNTs/GCE）。最后，在修饰电极表面滴涂5µL的BSA（1%）封闭MnO2@MWNTs纳米粒子上多余的结合位点。不使用时，将制备好的修饰电极保存在冰箱内。图3.1原理图显示了(A)Ab2/luminol–Pt@AuNFs/ChOx探针的制备过程，(B)多重信号放大策略机理，和(C)MnO2@MWNTs制备过程。随后，(I)展示了luminol分子结构，(II)和(III)分别展示了luminol-AuNFs和luminol-Pt@AuNFs的SEM图。Fig.3.1Theschematicdiagramsof(A)showthepreparationofAb2/luminol–Pt@AuNFs/ChOxprobes,(B)revealthemechanismofthemultiplesignalamplificationstrategyandthecomparativeECLsignalswiththetargetandwithoutthetarget,and(C)exhibitpreparationofMnO2@MWNTs,then(I)displaythestructureoftheluminalmolecule,(II)and(III)displaytheSEMimagesofluminol-AuNFsandluminol-Pt@AuNFs,respectively.3.2.6电极的测试过程及响应原理该测量根据双抗夹心模式，在测试之前，将免疫传感器在常温条件下浸于不同浓度的cTnI溶液中40min，抗原抗体的特异性反应使得免疫复合物层修饰到电极表面（cTnI/BSA/anti-cTnI/MnO2@MWCNTs/GCE）。最后，将该修饰有目标抗原的传感器与anti-cTnI/luminol-Pt@AuNFs/ChOx二抗复合物探针孵育40min，它通过免疫反应结合到电极表面。至此，目标传感器制备成功。免疫传感器的每一步修饰后都用PBS（pH7.4）冲洗。采用MPI-E型电致化学发光分析系统对所修饰-1电极的电致化学发光行为进行研究，测试底液为2mmolL胆碱氧化酶溶解在3-1mL的0.1molLPBS（pH7.4）中。检测过程中，光电倍增管的电压设置在800V，应用电压为0.2~0.8V，扫描速率为100mV/s。随着抗原cTnI浓度增加，二抗复合24 第四章基于银纳晶和联吡啶钌的双波长比率法电致化学发光能量转移免疫传感器物（anti-cTnI/luminol-Pt@AuNFs/ChOx）浓度也增大，luminol的ECL信号随着增加。因此，ECL强度的变化直接反应了cTnI浓度的变化。3.3结果与讨论3.3.1纳米材料表征如图3.2所示纳米材料的合成步骤中不同的形貌变化由扫描电子显微镜（SEM）检测。AuNFs为粒径在45±5nm的花状纳米粒子（图3.2A），之后Pt纳米粒子生长在AuNFs表面，Pt@AuNFs为一个更大的纳米粒子，粒径在110±10nm（图3.2B）。同时，图3.2C和D分别展现了MnO2沉积前后的碳纳米管形貌变化。原始的碳纳米管有30–50nm的粒径，光滑卷曲的形貌（图3.2C）。沉积MnO2后，碳纳米管的表面均匀的沉积了一层MnO2使其变得粗糙（图3.2D）。图3.2(A)luminol–AuNFs,(B)luminol–Pt@AuNFs,(C)MWCNTs,(D)MnO2@MWCNTs的SEM图。Fig.3.2TheSEMmicrographof(A)luminol–AuNFs,(B)luminol–Pt@AuNFs,(C)MWCNTs,(D)MnO2@MWCNTs.3.3.2luminol-Pt@AuNFs的紫外吸收谱图紫外吸收谱图被用于检测luminol-Pt@AuNFs是否成功合成。luminol-Pt@AuNFs的紫外吸收谱图（图3.3）在225nm，368nm，和385nm都有吸收峰，相较于luminol的紫外吸收峰（220nm，307nm，和348nm）出现红移，[86]这归结于Pt@AuNFs的量子尺寸效应。说明luminol被成功包裹在Pt@AuNFs粒子上。25 西南大学硕士学位论图3.3luminol-Pt@AuNFs(曲线a)和luminol(曲线b)的紫外吸收谱图。Fig.3.3UV-visibleabsorptionspectrumofluminol-Pt@AuNFs(blueline)andluminol(redline).3.3.3luminol-AuNFs及luminol-Pt@AuNFs的X射线电子能谱图为了进一步证明luminol-AuNFs（图3.4）和luminol-Pt@AuNFs（图3.5）成功合成，X射线电子能谱（XPS）被用于分析纳米复合物的元素成分。luminol-AuNFs的谱图中出现O1s,N1s,C1s和Au4f的特征峰，分别在537.68eV,405.98eV,292.73[87]eV和93.58eV（如图3.4B,C,D,和E所示）。随后，luminol-Pt@AuNFs的谱图中出现O1s,N1s,C1s,Au4f和Pt4f的特征峰，分别在536.23eV,405.48eV,291.33eV,[88]92.28eV和92.28eV（如图3.5B,C,D,E和F所示）。基于以上分析，我们证实luminol-AuNFs和luminol-Pt@AuNFs成功合成。图3.4luminol-AuNFs的X射线电子能谱图。Fig.3.4XPSanalysisforA)thefullregionofXPSforluminol-AuNFs,B)O1sregion,C)N1sregion,D)C1sregion,E)Au4fregion.26 第四章基于银纳晶和联吡啶钌的双波长比率法电致化学发光能量转移免疫传感器图3.4luminol-Pt@AuNFs的X射线电子能谱图。Fig.3.5XPSanalysisforA)thefullregionofXPSforluminol-Pt@AuNFs,B)O1sregion,C)N1sregion,D)C1sregion,E)Au4fregion,F)Pt4fregion.3.3.4免疫传感器的电化学表征铁氰化钾溶液作为氧化还原标记物，循环伏安法（CV）被用来表征ECL免疫传感器每一步构建过程。相应的CV曲线如图3.6A所示，当在裸电极上孵育MnO2@MWNTs后，由于其优异的导电性，其氧化还原峰（曲线b）相较于裸的玻碳电极（曲线a）有明显增强。当电极进一步孵育anti-cTnI后，抗体生物大分子阻碍电子的传递使得氧化还原峰明显有所下降（曲线c）。然后依次用BSA封闭非特异性结合位点（曲线d）和孵育cTnI抗原（曲线e）后，BSA以及抗原-抗体免疫复合物对电子传递的阻碍作用，CV曲线也依次进一步降低。此外，电化学交流阻抗技术是一种敏感的检测手段，适合研究复杂电极反应的电极表面行为，己经广泛用于电极表面修饰层的表征。在含有5.0mmol/LK3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6](1:1)的磷酸缓冲溶液（pH7.4）中，复平面阻两个方面的信息。高频部分是受动力学控制的区域，低频部分是受扩散控制的行为。图3.6B中a曲线是处理好的裸玻碳电极在高频部分有一个很小的半圆，在低频部分近似为一条直线，表明电极表面主要受扩散控制。当电极孵育MnO2@MWCNTs后，由于其具有良好的电子传输能力且其增大了电极的比表面积，所以曲线b的半圆直径减少，说明电极阻抗值降低。anti-cTnI蛋白分子固载到电极表面后，电极阻27 西南大学硕士学位论抗值明显增大（曲线c），这是由于形成了蛋白质分子层，不利于电子的传输。接着用BSA封闭多余结合位点（曲线d），进一步孵育上抗原（曲线e）后，电极阻抗值持续增大，这是由于蛋白质层阻碍电极表面电子的传输。图3.6免疫传感器修饰过程的循环伏安和交流阻抗表征。-1Fig.3.6CVs(A)andEIS(B)ofdifferentmodifiedelectrodesatPBScontaining5.0mmolLK3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6](1:1)asredoxprobe:(a)bareGCE,(b)MnO2@MWNTs/GCE,(c)anti-cTnI/MnO2@MWNTs/GCE,(d)BSA/anti-cTnI/MnO2@MWNTs/GCE,(e)cTnI/BSA/anti-cTnI/MnO2@MWNTs/GCE.ScanningofCVswasfrom-0.2to0.6Vwitharateof100mV/sandallpotentialsaregivenagainstSCE.3.3.5不同二抗标记物的响应性能对比为了证实目标免疫传感器的优异性，五种不同的Ab2标记探针被准备，包括，Ab2/luminol–Pt@AuNFs,Ab2/luminol–PtNFs/ChOx,Ab2/luminol–AuNFs/ChOx和Ab2/Pt@luminol–AuNFs/ChOx（其中抗坏血酸代替鲁米诺还原生成Pt纳米粒子）。同一批次的电极修饰了BSA/anti-cTnI/MnO2@MWNTs和0.1ng/mLcTnI，然后不同的Ab2复合物通过免疫夹心反应修饰在以上电极上。如图3.7A和B所示，目标电极上Pt@AuNFs纳米复合物分别取代为AuNFs和PtNFs来构建探针a(Ab2/luminol–AuNFs/ChOx)和b(Ab2/luminol–PtNFs/ChOx)。修饰了探针a的传感器产生4003a.u(图3.7A),修饰了探针b的传感器产生5071a.uECL信号值(图3.7B)。两种探针的比较说明了PtNFs模拟酶的催化作用。此外，免疫传感器孵育上探针Ab2/Pt@luminol–AuNFs/ChOx，ECL信号显著增加达到6278a.u(图3.7C)，信号值高于探针Ab2/luminol–PtNFs/ChOx修饰的传感器，低于目标电极（7537a.u）。所以我们推测luminol–Pt@AuNFs纳米复合物作为载体有更大的比表面积吸附更多的ChOx，固载更多的luminol。随后，探针Ab2/luminol–Pt@AuNFs孵育上免疫传感器，由于缺少ChOx无法产生H2O2，因此免疫传感器无法获得满意的发光效率。总而言之，目标传感器的优点可以归纳为以下几点：（1）ChOx催化胆碱可以原位··−生成高浓度的H2O2；（2）模拟酶Pt@AuNFs可以催化H2O2生成OH和O2直接促进鲁米诺的ECL发光强度；（3）Pt@AuNFs作为载体可以固载更多的ChOx和鲁28 第四章基于银纳晶和联吡啶钌的双波长比率法电致化学发光能量转移免疫传感器米诺。这些原因充分的解释了目标探针Ab2/luminol–PtNFs/ChOx可以产生高的ECL信号超灵敏的检测cTnI。图3.7免疫传感器与不同的二抗复合物反应的ECL示意图。Fig.3.7ECLprofilesofthedifferentsandwichformatimmunosensorsintheabsenceof(a,blueline)andinthepresenceofAb2bioconjugates(b,redline).TheconcentrationofcTnIwas0.1ng/mL.-1Workingsolution,PBS(pH7.4)containing2mmolLChOx.3.3.6免疫传感器的响应性能在最优条件下，我们探索目标电极的定量范围从0.05pg/mL到0.1ng/mL,ECL信号线性增加，检出限为0.017pg/mL(S/N=3)。该线性回归方程为y=9519.02+22202.89lgc，相关系数R=0.9989。根据线性方程，该方法可以用于cTnI浓度的定量检测（图3.8A）。同时，我们将目标电极和先前的报道对照研究（表3.1），该方法展现了低的检出限和宽的线性范围，目标电极相较于上一个体系有更灵敏的cTnI检测水平。表3.1不同cTnI检测方法检出限的比较Tab.3.1ComparisonofourresearchwithothermethodsforcTnIdetection.-1-1MeasurementprotocolLinearrange/(pg·mL)Detectionlimit/(pg·mL)ReferencesElectrochemical800~5000500Guoetal.Optomagneticbiosensor30~650030Dittmeretal.aELISA100~1000027Choetal.Electrochemiluminescence2.5~100002Shenetal.Electrochemiluminescence0.05~1000.017Presentworkaenzyme-linkedimmunosorbentassay.29 西南大学硕士学位论3.3.7免疫传感器的稳定性、选择性以及重现性我们通过连续扫描不同浓度抗体cTnI修饰的免疫传感器来证明它的稳定性，如图3.8B所示，随着cTnI浓度的增加ECL信号增强，并且在每个浓度下都呈现了相应的稳定性。我们设计了对照试验来进一步探究传感器的选择性（如图3.8C所示）。免疫球蛋白(IgG)，氨基末端脑钠肽前体(BNP)，和牛血清蛋白(BSA)作为干扰物质评估传感器的选择性。0.1ng/mLIgG,0.1ng/mLBNP和0.1ng/mLBSA分别孵育，传感器几乎没有信号。然后传感器孵育上0.01ng/mLcTnI和不同的干扰物质，相较于仅孵育上0.01ng/mLcTnI的传感器，两者获得几乎相似的信号。以上结果说明目标传感器拥有好的选择性。图3.8(A)免疫传感器对不同浓度的cTnI的检测，(B)选择性示意图和(C)稳定性Fig.3.8(A)ECLprofilesoftheimmunosensorinthepresenceofdifferentconcentrationsofcTnIbasedonsandwich-typeformat.(B)TheECLstabilityofproposedimmunosensortovariousconcentrationsofcTnI.(C)TheselectivityoftheproposedECLimmunosensor.3.3.8免疫传感器的初步应用此外，我们在人血清中采用标准加入法检测了免疫传感器的实用性。六份血清被稀释至合适的溶剂中，然后孵育在目标电极上检测相应的ECL信号。如表3.2所示，得到回收和相对标准偏差值从90.0%到107%，证实了该免疫传感器可以合理地应用于临床cTnI测定。表3.2实际样品检测Tab.3.2Preliminaryanalysisofrealsamples.-1-1SamplenumberAdded/(ng·mL)Found/(ng·mL)Recovery/%10.05000.052010420.04000.039097.530.03000.031510540.02500.021890.050.01000.010710760.005000.0045691.230 第四章基于银纳晶和联吡啶钌的双波长比率法电致化学发光能量转移免疫传感器3.4总结综上所述，本工作基于鲁米诺-Pt@AuNFs纳米复合物设计了一个新颖多面的ECL平台用于超灵敏的检测cTnI。其中，鲁米诺连接Pt@AuNFs形成新颖的纳米复合物，提供了一个大的比表面积固载了大量的Ab2和ChOx(Ab2/luminol–Pt@AuNFs/ChOx)。鲁米诺的ECL反应被显著增强包括催化ChOx原位生成H2O2和H2O2被Pt@AuNFs模拟酶催化分解。该体系的cTnI检出限低于费摩级别，并且预期该方法可以扩展探测多种分析物分子。31 西南大学硕士学位论第四章基于银纳晶和联吡啶钌的双波长比率法电致化学发光能量转移免疫传感器4.1引言光共振能量转移（LRET）是一种基于纳米级别的供体和受体（传统粒径小于[89]10nm）能量转移的分子光谱方法。在过去的十年中，各种光共振能量转移，包[90][91]括荧光共振能量转移（FRET），化学发光共振能量转移（CRET），生物发[92][93]光共振能量转移（BRET），和电致化学发光共振能量转移（ECL-RET），由于它们高灵敏性，被广泛的报告和应用在生物分析中。比率分析法是一种以双信号比值取代绝对值的量化方法，随着它的应用，ECL-RET基于标准背景信号，散射光和假阳性信号等环境变化，可以提供更精准的定量测定。基于以上优点，我2−们团队设计了基于O2/S2O8和氨基化苯环衍生物之间的双电压电致化学发光能量[94]转移体系，并用于铅离子检测。南京大学朱俊杰小组设计了一种通过测定[95]ECLluminol/ECLCdS比值的双电压电致化学发光能量转移体系。[96]从巴德课题组在2002年报道了硅量子点的电致化学发光性能，制备和应用各种具备电致化学发光性能的纳米晶是多方研究的重点。迄今为止，不同类型的[97][98][99]电致化学发光纳米材料，包括半导体量子点（QDs），碳点，和金属纳米簇[100][101][102]被成功应用在光电子和生命科学，如生物传感器，分子成像，和纳米医药。在这个工作中，我们在LiClO4-glycine缓冲对中通过电沉积的方法在电极表面电沉积生成银纳米簇（AgNCs）。同时AgNCs在458nm产生了显著的阴极电致化学发光。作为一个有效的ECL基团，AgNCs因其优异的特性，如易于制备、低毒性、方便标记、和优异的稳定性。但是AgNCs的ECL效率低于鲁米诺、联吡啶钌等传统的ECL试剂，同时由于AgNCs的ECL激发电位过高，其生物检测的应用是有限的。因此，我们采用适当的受体来构建ECL-RET体系来促进AgNCs的发光性质。幸运地，联吡啶钌由于金属配体电子转移吸收，在470nm有一个明显的紫外[103]吸收峰。因此，AgNCs和联吡啶钌之间成功构建了高效的ECL-RET体系。综上所述，由AgNCs（ECL供体）和联吡啶钌（ECL受体）构建的双波长比率法电致化学发光免疫传感器用于超灵敏cTnI的检测。玻碳电极（GCE）沉浸在-1包含了1mmolLAgClO4的LiClO4-glycine缓冲液中，在0至1.2V的电压下扫描，AgNCs直接电沉积在玻碳电极（GCE）上。随后，Ab1（anti-cTnI）通过Ag-N或是Ag-S共价键固载在AgNCs修饰的GCE上（AgNCs/GCE）。此外，MWNTs被2+雇用为纳米载体，通过酰胺反应Ru(bpy)3被固载上MWNTs，制备32 第四章基于银纳晶和联吡啶钌的双波长比率法电致化学发光能量转移免疫传感器2+2+Ru(bpy)3/MWNTs纳米复合物。在接下来的实验中，Ru(bpy)3/MWNTs显示了高稳定性、高效的ECL强度同时容易标记Ab2（anti-cTnI）。最后，随着Ab2固载量的增加，AgNCs的ECL强度在458nm越下降，联吡啶钌的ECL强度在650nm越上升。进一步的调查显示制备好的夹心免疫传感器采用ECL能量转移对（AgNCs-联吡啶钌）达到高灵敏检测cTnI。因此，该策略提供了一种新颖的高灵敏检测方法可试用于多种生物分子。4.2实验部分4.2.1试剂和仪器高氯酸银（无水，97%），联吡啶钌（Ru(bpy)3Cl2·6H2O），牛血清白蛋白（BSA,96~99%）均购于Sigma公司（美国）。高氯酸锂（LiClO4）购于化学试剂国药控股有限公司（中国，上海）。甘氨酸（glycine）购买自成都科龙化学公司（中国，成-1-1都）。LiClO4-glycine缓冲对含浓度0.1molLLiClO4和0.1molLglycine，用0.1-1molLHCl或NaOH将缓冲对调至pH=6.86。人心肌肌钙蛋白抗原（cTnI）和cTnI鼠单克隆抗体（anti-cTnI）购买自上海华裔公司（纯度高于95%）（中国，上海）。o所有溶液使用前均保存在4C下。ECL发光由传统的MPI-A型电致化学发光分析仪检测（西安瑞迈仪器公司）。检测过程中光电倍增管（PMT）的电压设置为800V，扫描速率为100mV/s。在ECL体系中，一系列的光学过滤片被放置在电极和PMT之间，从275到825nm范围内循环扫描，计算固定波长下最大的ECL强度。循环伏安法（CV）由CHI660e型电化学工作站（上海辰华仪器公司）测量。不同纳米材料的形貌特征由透射电镜（TEM，H600，日本日立公司）表征。紫外吸收光谱由UV-2550分光光度计测量（岛津公司，日本）。RF-5301PC荧光分光光度计（日本东京日本岛津公司有限公司）与标准石英比色皿（10mm光学路径长度和3.5mL高度）。4.2.2银纳米簇的制备在修饰前，玻碳电极（GCE，Φ=4mm）用0.3,0.05µm的Al2O3粉抛光并用蒸馏水和无水乙醇依次冲洗干净，清洗后的电极置于室温下自然晾干备用。2mmol-1-1LAgClO4溶解在2mL的LiClO4-glycine缓冲对（pH=6.86,0.1molL）中作为电沉积底液，并在氮气中除氧15min，保持电沉积过程处在一个惰性环境下。三电极体系用于银纳米簇电化学修饰GCE过程中。在0至1.2V的循环电压扫描下AgNCs原位生成在GCE的表面。33 西南大学硕士学位论2+4.2.3Ru(bpy)3/MWNTs的制备2+Ru(bpy)3/MWNTs纳米复合物的完整制备过程细致地展示在了图4.1中。单纯的MWNTs（50mg）溶解在20mL的H2SO4和HNO3混合液（体积比3:1）中，随后，混合溶液在100ºC下回流1h以确保MWNTs的羧基化。混合溶液离心并用超纯水洗涤多次以过滤掉多余的酸，400mgEDC和100mgNHS溶解在12+mLMWNTs的均匀溶液中以活化羧基。然后4.5mgRu(bpy)3溶解在上述溶液中，2+磁力搅拌下6h在Ru(bpy)3的NH2基和MWNTs的COOH基之间生成肽键。最后的溶液离心10min，吸走上层溶液，下层溶液用超纯水稀释洗涤三次以上。收集2+下层沉积物（Ru(bpy)3/MWNTs）并分散在1mL的PBS（pH7.4）中。2+4.2.4制备BSA/Ab2/Ru(bpy)3/MWNTs探针2+混合1mLRu(bpy)3/MWNTs纳米复合物，200µLcTnI抗体溶液和400mgoEDC以及100mgNHS在4C条件连续搅拌6h，anti-cTnI通过Au–N键或Au–S键固载在纳米复合物上。随后加入1mL的BSA(5%)固载在纳米复合物上以封闭2+纳米复合物表面未修饰的位点。最后，通过离心三次以上得到anti-cTnI/Ru(bpy)3/oMWNTs/BSA纳米复合物，并分散于1mLPBS中后储存于4C下备用。4.2.5免疫传感器的制备2+2-图4.1原理图中(A)显示Ab2/Ru(bpy)3/MWNTs探针和电极的制备过程，(B)AgNCs在S2O8体系中的发光机理，(C)ECL-RET机理。2+Fig.4.1Theschematicdiagramsshowed(A)preparationofAb2/Ru(bpy)3/MWCNTsprobeandthe2−immunosensorfabrication,(B)ECLmechanismofAgNCs/S2O8,and(C)possiblemechanismof2+2−ECL-RETbetweenAgNCsandRu(bpy)3insolutionofS2O8.免疫传感器的构建如图4.1所示：首先，在预处理的GCE表面电沉积上一层34 第四章基于银纳晶和联吡啶钌的双波长比率法电致化学发光能量转移免疫传感器AgNCs，自然晾干得至AgNCs修饰的玻碳电极（AgNCs/GCE）。然后，将该修饰o电极浸入0.5mg/mL的anti-cTnI溶液中并4C孵育4h，通过基底的羧基和抗体分子上的氨基之间的酰胺化反应将抗体分子牢牢的组装至电极表面。最后，用1%的BSA溶液封闭AgNCs上多余的结合位点（BSA/anti-cTnI/AgNCs/GCE）。得到的修饰电极不使用时保存在冰箱内。4.2.7电极的测试过程及响应原理该测量根据双抗夹心模式，在测试之前，将免疫传感器在常温条件下浸于不同浓度的cTnI溶液中40min，抗原抗体的特异性反应使得免疫复合物层修饰到电极表面（cTnI/BSA/anti-cTnI/AgNCs/GCE）。最后，将该修饰有目标抗原的传感器2+与anti-cTnI/Ru(bpy)3/MWNTs/BSA二抗复合物探针孵育40min，它通过免疫反应结合到电极表面。至此，目标传感器则制备成功。免疫传感器的每一步修饰后都用PBS（pH7.4）冲洗。采用MPI-E型电致化学发光分析系统对所修饰电极的电2-致化学发光行为进行研究，测试底液为1mmol/LS2O8溶解在3mL的PBS中。检测过程中，电压为−2~0V，扫描速率为100mV/s。随着抗原cTnI浓度增加，二抗2+复合物浓度也增大，AgNCs的ECL信号随着降低，Ru(bpy)3的ECL信号随着增加。因此，ECL强度的变化直接反应了cTnI浓度的变化。4.3结果与讨论4.3.1纳米材料表征图4.2(A)AgNCs的TEM图，(B)能量色散X射线图，(C)高清TEM图和相应电子选取衍射图。Fig.4.2(A)TEMimageand(B)theEDXoftheAgNCs.(C)AtypicalHRTEMimageofaselectedareaofanindividualAgNCswiththeSAEDpatternshownintheinset.AgNCs的形貌特征由透射电子显微镜（TEM）检测，如图4.2A所示，AgNCs为分布均一粒径在3.0nm的纳米微球。随后，图4.2B显示了AgNCs能量色散x射线（EDX）的分析结果，C(0.27keV),N(0.39keV),O(0.49keV)和Ag(3.1keV)[104]元素的存在证明了AgNCs制备成功。此外，AgNCs纳米微球的高分辨透射电子显微镜（HRTEM）结果（图4.2C）显示一系列的二维晶格条纹有序、整齐地排35 西南大学硕士学位论列。同时，图4.2C的插图中，电子束直接入射垂直于纳米微球中的某个部分获得相应的电子选取衍射图（SAED）。清晰的衍射点组代表了面心立方银纳米晶的(111),[105](202),(022)和(220)晶面，同时也表明了它的单晶结构。4.3.2AgNCs的电化学性质我们雇用循环伏安法（CV）来阐明AgNCs的光生成机制和电化学性质，在单-12-纯的PBS和含有1mmolLS2O8的PBS进行对比实验，相应的结果如图4.3A所-12-示。首先，裸电极在含有1mmolLS2O8的PBS中循环扫描，在−1.34V下产生一个还原峰（曲线b），当裸电极在单纯的PBS中循环扫描没有产生还原峰（曲线-12-a）。其次，AgNCs/GCE在含有1mmolLS2O8的PBS中循环扫描，CV曲线在−1.20V时产生显著的还原峰，相较于裸电极，还原峰产生红移，同时还原电位更大。2-·-这表明S2O8可以还原AgNCs并且增加了氧化自由基（SO4）含量。另一方面，我们将AgNCs修饰的GCE静置在有机相中循环扫描来消除负电压下电解水的干扰。相应的结果如图4.3B所示，裸电极在乙腈电解质溶液中循环扫描没有产生还原峰（曲线d），但AgNCs/GCE在乙腈电解质溶液中产生显著还原峰（曲线d’），表明AgNCs负电压下可以被还原。图4.3不同修饰电极的循环伏安表征。Fig.4.3(A)CyclicvoltammogramsofbareGCEinPBS(curvea),bareGCE(curveb)andAgNCs/-12-GCEinPBScontaining1mmolLS2O8(curvec),insert:theamplificationofcurvea,bandc.(B)bareGCE(curved)andAgNCs/GCE(curved’)inacetonitrileelectrolytesolution.4.3.3合理的ECL-RET机理2+图4.4A展示了Ru(bpy)3的紫外可见谱图在460nm有一个明显的吸收峰（曲线a）。同时，AgNCs/GCE的ECL谱图在大约458nm位置出现发射峰（曲线b）。相应地，AgNCs的荧光谱图在450nm位置出现发射峰（图4.4A中插图）。显而易2+见，AgNCs的ECL发射峰和Ru(bpy)3的吸收峰完美的重叠，这表示了从AgNCs2+-12-到Ru(bpy)3高效的ECL能量转移。此外，在包含了1mmolLS2O8的PBS中，2+AgNCs被还原产生了显著的阴极ECL发光（图4.4B中的曲线b）。当Ru(bpy)336 第四章基于银纳晶和联吡啶钌的双波长比率法电致化学发光能量转移免疫传感器2+在负电压的扫描下仅有微弱的ECL发光，这表明Ru(bpy)3可以作为合适的AgNCs2+能量受体。在修饰了Ru(bpy)3/MWNTs之后，ECL强度显著地高于单纯的AgNCs。图4.4C中的曲线a显示了AgNCs/GCE仅在458nm有ECL发光。当电极分别修饰上10pg/mLcTnI和Ab2功能化探针（曲线b），新的ECL发射峰出现在650nm，2+2+此为Ru(bpy)3的ECL发射峰。总而言之，随着cTnI的孵育量增大，Ru(bpy)3在650nm的ECL信号增加，AgNCs在458nm的ECL信号降低，这说明了AgNCs2+和Ru(bpy)3之间产生高效的ECL能量转移。2+图4.4(A)Ru(bpy)3紫外吸收图和AgNCs的ECL光谱，插图为AgNCs的荧光光谱,(B)不同修饰电极的ECL表征,(C)不同抗原浓度的ECL-RET表征图。2+Fig.4.4(A)UV−visabsorptionspectraofRu(bpy)3andECLspectrumofAgNCs.Insetisthe2+fluorescenceemissionoftheAgNCs.(B)ECLcurvesof(a)Ru(bpy)3/MWNTs/GCEinPBS,(b)2+-12-AgNCs/GCEand(c)Ru(bpy)3/MWNTs/AgNCs/GCEinPBScontaining1mmolLS2O8.(C)TheECLspectraof(a)theblankelectrode,(b)themodifiedelectrodewith10pg/mLcTnIand(C)100pg/mLcTnI.4.3.4AgNCs的ECL发光机理-12-图4.5展示了含有AgNCs/GCE在1mmolLS2O8的PBS循环扫描产生CV曲线和相应的ECL-电压曲线。如曲线b所示，在−1.20V时，出现ECL发光，此2-·2-时S2O8被还原为S2O8（等式2），在共反应试剂途径中AgNCs被还原为带负电·-[106]·2-·-的Ag自由基（Ag）,（等式1）。随后，S2O8分解生成强氧化性自由基（SO4）,·-（等式3）,此时一个电子传递到Ag生成Ag*（等式4）。激发态的Ag*将电子传·-[107]递给SO4回到基态，发射出显著的电致化学发光（等式5）。AgNCs/GCE和2-S2O8之间的反应图解展现在图4.5中，可能的机理描述在以下的方程中。37 西南大学硕士学位论2-图4.5在S2O8(pH7.4)体系中AgNCs/GCE的循环伏安图(曲线a)和相应的ECL(曲线b)。Fig.4.5Cyclicvoltammograms(curvea)anditscorrespondingECLcurves(curveb)ofAgNCs/-12-GCEinPBScontaining1mmolLS2O8(pH7.4),andstep-by-stepschematicillustrationsof2-reactionbetweenS2O8andAgNCs/GCEwiththepotentialscanof−3and0V.4.3.5生物传感器对cTnI的分析性能2+基于以上结果，AgNCs和Ru(bpy)3之间产生高效的电致化学发光能量转移能量转移，并被应用于不同浓度的cTnI的灵敏检测。如图4.6A所示，随着cTnI的2+孵育量增大，Ru(bpy)3在650nm的ECL信号增加，相应的线性方程为lg(I650nm)=1294.8lgc+7819.0，相关系数R=0.9920；AgNCs在458nm的ECL信号相应降低，相应的线性方程为lg(I458nm)=-155.38lgc+28.572，相关系数R=0.9908。为了更加准确的检测抗原浓度，我们通过计算ECL650nm/ECL458nm比例来检测cTnI的浓度。在1.0ng/mL到1.0pg/mL范围内，ECL650nm/ECL458nm的对数值和cTnI浓度的对数值呈现良好的线性关系，线性方程为lg(I650nm/I458nm)=0.4986lgc+2.5575，相关系数R=0.9969，检出限为0.33pg/mL（S/N=3）。38 第四章基于银纳晶和联吡啶钌的双波长比率法电致化学发光能量转移免疫传感器2+图4.6(A)不同浓度cTnI和(a)AgNCs或(b)Ru(bpy)3ECL强度的线性关系。(B)不同浓度cTnI2+与AgNCs和Ru(bpy)3的ECL强度比值的线性关系。2+Fig.4.6(A)RelationshipbetweentheECLintensityof(a)AgNCsat458nmor(b)Ru(bpy)3at650nmandthelogarithmicofconcentrationofcTnI(from0.01pg/mLto1.0ng/mL).(B)Relationship2+betweentheratioofECLsignalat458nm(AgNCs)toECLsignalat650nm(Ru(bpy)3)andtheconcentrationofcTnI.4.3.6免疫传感器的选择性为了进一步探究传感器的选择性和重现性，我们设计了对照试验来调查该传感器的（如图4.7所示）。免疫球蛋白(IgG)，氨基末端脑钠肽前体(BNP)，和牛血清蛋白(BSA)作为干扰物质评估传感器的选择性。0.1ng/mLIgG,0.1ng/mLBNP和0.1ng/mLBSA分别孵育，相较于背景信号传感器的ECL650nm/ECL458nm数值几乎没有变化。然后传感器孵育上0.01ng/mLcTnI和不同的干扰物质，相较于仅孵育上0.01ng/mLcTnI的传感器，两者获得几乎相似的信号。以上结果说明构建的双波长比率法ECL-RET免疫传感器拥有好的选择性。图4.7免疫传感器对cTnI检测的选择性。Fig.4.7Theselectivityoftheproposedimmunosensor:Blank,BSA(100ng/mL),IgG(100ng/mL),cTnI(1ng/mL)andamixturecontainingBSA(100ng/mL),IgG(100ng/mL)andcTnI(1ng/mL).4.3.7免疫传感器的初步应用此外，我们在人血清中采用标准加入法调查了免疫传感器的实用性。六份血清被稀释至合适的溶剂中，然后赋予上目标电极上检测相应的ECL信号。结果如39 西南大学硕士学位论表4.1所示，得到回收和相对标准偏差值从98.9%到108%，证实了该免疫传感器可以合理地应用于临床cTnI测定。表4.1实际样品检测Tab.4.1Preliminaryanalysisofrealsamples.-1-1SamplenumberAdded/(ng·mL)Found/(ng·mL)Recovery/%10.5000.50310120.1000.10810830.05000.049599.040.01000.0098998.950.005000.0049799.460.001000.001021024.4总结在双波长比率法ECL-RET体系中，银纳米簇作为一种电致化学发光试剂被证明可作为一种有效稳定的电致化学发光供体。相较于传统在溶液中的纳米簇，我2+们制备的银纳米簇被直接电沉积在了电极上。随后，AgNCs和Ru(bpy)3之间发生高效的电致化学发光能量转移，继而产生更强的阴极ECL信号，从而达到cTnI的灵敏检测。通过计算ECL650nm/ECL458nm比例来检测cTnI的浓度，在1.0ng/mL到0.01pg/mL范围内，ECL650nm/ECL458nm的对数值和cTnI浓度的对数值呈现良好的线性关系，检出限为0.33pg/mL。我们ECL-RET体系构建了一种新颖的途径来增强发光AgNCs，以拓宽AgNCs的分析应用。40 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西南大学硕士学位论作者部分相关论文题录YingZhou,YingZhuo,NiLiao,YaqinChai*andRuoYuan*.Ultrasensitiveimmunoassaybasedonapseudobienzymeamplifyingsystemofcholineoxidaseandluminol-reducedPt@Auhybridnanoflowers.Chem.Commun.,2014,50,14627-14630.YingZhou,YingZhuo,NiLiao,YaqinChai*andRuoYuan*.UltrasensitiveelectrochemiluminescentdetectionofcardiactroponinIbasedonaself-enhancedRu(II)complex.Talanta,2014,129,219-226.YingZhou,YingZhuo*,YaqinChaiandRuoYuan*.Dual-Wavelengthratiometricelectrochemiluminescenceimmunosensorbasedonresonanceenergy2+transferbetweensilvernanocrystalsandRu(bpy)3forcTnIdetection.(Submission)48 致谢致谢三年前的三四月份，也是这样温热潮湿的春天，我也处于对求学生活的迷茫。起起落落中，接到一个声音很好听北方口音的女老师的电话，一个奇妙的下午，我匆匆买了车票，对于离家20个小时车程的陌生远方，唯一的准备是找到了一个同学的同学的同学作为西大向导，可就这样的不经意，我决定了自己之后三年的生活。三年，我不太能去评判生活里的酸甜苦辣是否美好，毕竟还是有很多遗憾、挫折和泪水，所幸可以和自己说，我不会因碌碌无为而悔恨，我不会因孑然一身而伤感，所幸我的生活里有美好的你们。谢谢老天安排的缘分，谢谢恩师袁若教授和柴雅琴教授，还有美丽的大姐姐卓颖老师，你们一直的教诲、鼓励和肯定，让我能在这个优秀的平台筑建自己的科研梦想。谢谢404这个温暖大家庭里的每一员，你们的陪伴让枯燥的科研也变得生动有趣，和你们在一起的点点滴滴都显得弥足珍贵。谢谢我的家人，你们的宽容和支持，是漂泊学子永远的避风港。还有很多想要感谢的老师和同门，不再一一列出，相聚和离开都有时候，唯愿你们如初见时美好。周莹2016/3/2049