三氯乙烯抑制人胚胎干细胞向心肌分化的机制研究

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1、SOOCHOWUNIVERSITY硕士学位论文论文题目____________三氯乙烯抑制人胚胎干细胞________________向心肌分化的机制研究研究生姓名________________王丹指导教师姓名___________王国卿姜岩_专业名称________________生理学________研究方向______________心血管生理论文提交日期______________2015年！月_______苏州大学学位论文独创性声明本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中己经注明引用的内容外，本论文不含其

2、他个人或集体己经发表或撰写过的研宄成果，也不含为获得苏州大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研宂作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的法律责任。论文作者签名：日期：年牛，苏州大学学位论文使用授权声明本人完全了解苏州大学关于收集、保存和使用学位论文的规定，即：学位论文著作权归属苏州大学。本学位论文电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。苏州大学有权向国家图书馆、中国社科院文献信息情报中心、中国科学技术信息研宄所（含万方数据电子出版社)、中国学术期刊（光盘版）电子杂志社送交本学位论文的复印件和电子文档，允许论文被査阅和借阅，

3、可以采用影印、缩印或其他复制手段保存和汇编学位论文，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索。涉密论文口本学位论文属7______年_月解密后适用本规定。非涉密论文论文作者签名：科日期：导师签名:H幻邡f曰期：三氯乙烯抑制人胚胎干细胞向心肌分化的毒性机制研究中文摘要中文摘要目的：探讨三氯乙烯(TCE)对人胚胎干细胞向心肌细胞分化的影响及其机制。方法：以人胚胎干细胞H9体外心肌定向分化为基础，培养液中添加不同剂量的TCE（处理组分别为：100ppb组，1ppm组，10ppm组）以及二甲基亚砜（DMSO，对照组）。对诱导后形成的拟胚体以及不同发育阶段的细胞

4、进行检测：MTT法测定细胞生存力，直观统计拟胚体自主节律性搏动次数，流式细胞仪计数分析细胞分化比例，荧光定量PCR检测心肌特异性基因表达，免疫荧光法检测各个时期相关蛋白表达，基因芯片法观察TCE对心肌细胞钙离子通道相关基因表达的影响。结果：1.胚胎干细胞向心肌成功定向分化随着时间的推移，细胞依次经过多能干细胞期，拟胚体悬浮期以及自发节律性搏动的贴壁拟胚体形成期。可以观测到胚胎干细胞(ESC)形态发生变化，用阶段特异性标记物作RT-PCR，结果显示心肌细胞分化成功。2.TCE的细胞毒性作用MTT法显示，所检测的浓度对于未分化的胚胎干细胞和终末分化的心肌细胞的细胞活性

5、均不产生明显的细胞毒性作用(n=12,P>0.05)。说明所用剂量的TCE本身不影响细胞活性。3.TCE抑制人胚胎干细胞的心肌定向分化随着体外培养时间的延长，观测到的拟胚体搏动数目增加，自发搏动拟胚体发生的时间比对照组向后推移，流式细胞检测显示，随着TCE浓度增加，心肌特I中文摘要三氯乙烯抑制人胚胎干细胞向心肌分化的毒性机制研究异性标志物cTnt的阳性率不断降低，表明TCE对于心肌分化的抑制具有明显的剂量依赖性。收集培养D21的各组剂量处理的细胞，用免疫荧光法检测cTnt蛋白表达，结果显示细胞受累区域明显增大。4.TCE抑制心肌分化阶段标志物的表达TCE对于多能基

6、因Nanog、Tert和Sox2、中胚层形成相关基因Gata4和T的表达水平没有显著影响(P>0.05)。但TCE能够显著影响成熟期心肌标志物cTnt和Mhy-7的表达水平，并呈现一定的剂量依赖性下调，说明TCE影响心肌细胞从心肌前体期到成熟心肌分化的转变。5.TCE对心肌钙离子通道相关基因表达的影响q-PCR结果显示钙离子通道相关基因Serca2和Cav1.2表达水平显著下调，说明TCE干扰心肌细胞钙离子通道基因的表达。将具有自主性节律搏动的心肌细胞进行芯片分析，发现这些能够自主搏动的细胞其钙离子通道相关基因的数目总体呈现下调。结论：三氯乙烯抑制心脏祖细胞向心肌

7、细胞的分化过渡，降低成熟心肌分化的比例，干扰Ca2+通道相关基因的表达，造成心肌细胞分化发育障碍及其自发搏动低下。关键词：三氯乙烯；人胚胎干细胞；心肌分化；基因表达；钙离子通道相关基因作者：王丹指导教师：王国卿姜岩II三氯乙烯抑制人胚胎干细胞向心肌分化的毒性机制研究英文摘要Studyonmechanismoftrichloroethylene-induceddifferentiatedinhibitionfromhumanembryonicstemcellstocardiomyocytesAbstractObjective:Toinvestigateeffects

8、oftri