马疱疹病毒1型神经致病因子ul24基因转录调控机制的研究

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1、密级：论文编号:中国农业科学院/丄、人-VV学位论又马疮疹病毒1型神经致病因子UL24基因转录调控机制的研究TranscriptionalRegulationMechanismofEquineHerpesvirus1NeuralPathogenicFactorUL24硕士研究生：马月指导教师：王晓钧研宄员申请学位类别：兽医硕士专业领域名称：兽医学培养单位:哈尔滨兽医研究所研宄生院2015年6月Secrecy:No.ChineseAcademyofAgriculturalSciencesDissertationTranscriptiona

2、lRegulationMechanismofEquineHerpesvirus1NeuralPathogenicFactorUL24M.S.Candidate：MAYueSupervisor：Prof.WANGXiao-junDegree：MasterofVeterinaryMedicineSpecialty:VeterinaryMedicineJune2015摘要马疱疹病毒1型（EquineHerpesvirus1,EHV-1）为引起马属动物流产、瘫痪、共济失调、神经性脑脊髓炎的主要病原。EHV-1主要编码6种调控蛋白，包括1个极早期

3、蛋白（IE）、4个早期蛋白（IR2、EICP0、EICP22、EICP27）以及1个晚期蛋白（ETIF）。这些蛋白对自身病毒基因的转录调控起着关键作用。EHV-1的76个基因中，启动子结构明确的只有8个，分别为gK、IR5、IE、IR2、EICP0、EICP22、EICP27和ETIF，EHV-1调控蛋白对自身启动子调控特征的研究更是十分有限。UL24基因在所有疱疹病毒科中高度保守性，其编码的蛋白与神经致病性密切相关。EHV-1神经系统条件性致病依赖于病毒自身对UL24基因转录的调控。目前，EHV-1UL24基因转录调控的相关研究还未见

4、报道，本研究以马疱疹病毒1型（EHV-1）UL24基因（ORF37）为研究对象，研究UL24启动子在EHV-1基因组中的精确定位以及UL24基因转录调控的分子机制等科学问题。本研究中，利用5′RACE方法，确证了UL24开放阅读框上游的两个转录起始位点Tss1和Tss2，分别定位于基因组70118bp和70397bp；根据转录起始位点所在基因序列特征，构建UL24启动子报告重组质粒（pUL24I、pUL24II-1、pUL24II-2、pUL24II-3、pUL24II-4、pUL24II-5、pUL24II-6、pUL24II-7、p

5、UL24II-8），利用双荧光素酶报告检测系统确证了UL24I与UL24II-5分别为Tss1和Tss2对应的启动子，且二者所含核心元件不同，分别为TATA盒子和起始子（INR）；同时克隆EHV-1调控蛋白基因，构建真核表达重组质粒（pIE、pIR2、pEICP0、pEICP22、pEICP27、pEICP27-Flag、pETIF），经Westernblotting检测，验证了EHV-1调控蛋白的表达；为了检测调控蛋白对UL24启动子活性的影响，我们通过共转染UL24启动子报告重组质粒与调控蛋白真核表达重组质粒，利用双荧光素酶报告检测

6、系统进行检测，结果表明：EHV-1六种调控蛋白对UL24的不同的启动子调控模式相似，启动子UL24I和UL24II-5在EICP0蛋白作用下，活性分别升高2.3倍和17.5倍；在EICP22蛋白作用下，活性分别升高2.4倍和6倍；在ETIF蛋白作用下，活性分别升高1.8倍和4倍。与之相反，启动子UL24I和UL24II-5在IR2蛋白作用下，活性分别下降43.4倍和26.3倍；在IE蛋白作用下，活性分别下降2.3倍和3.9倍；EICP22可与IE蛋白协同增强UL24I启动子活性。同时，本研究利用免疫共沉淀技术和激光共聚焦技术，以EICP

7、27蛋白为参照，探索EICP22蛋白增强UL24启动子活性的机制，结果表明，EICP22蛋白增强UL24启动子活性不依赖于EICP22蛋白与转录因子TBP间的相互作用。本研究结果揭示了UL24基因转录调控方面的新机制，为后续神经条件性致病机理研究提供理论线索和实验依据。关键词：马疱疹病毒1型，转录调控，神经致病因子，UL24IAbstractEquineherpesvirus1(EHV-1)isasignificantetiologicagentofabortion,paralysis,ataxia,andencephalomyelit

8、iswithneuralsymptoms.TherearesixregulatoryproteinsofEHV-1,includinganimmediatelyearlyprotein(IE),fourea