转运sirna的双靶向长循环多功能信封式纳米基因载体的研究

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1、分类号：R944.9密级：非密UDC：610学校代码：11065硕士学位论文转运siRNA的双靶向长循环多功能信封式纳米基因载体的研究魏海田指导教师孙勇教授学科专业名称药剂学论文答辩日期2015年5月31日摘要本课题制备了一种转运siRNA的非病毒双靶向长循环多功能信封式纳米装置（MultifunctionEnvelop-typeNanoDevice,MEND）。MEND为复合纳米脂质体，同时具有脂质体和纳米粒的特性，通过对其脂质成分进行修饰，达到长循环和肝癌细胞双重靶向的目的，转染效率提高。修饰后的脂质分子结构为：甘草次酸（Glycyrrhetinic,GA）-聚乙二醇（P

2、olyethyleneglycol,PEG）-肽（Peptide,Pp,基质金属蛋白酶MMP的底物）-二油酰磷脂酰乙醇胺（1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine,DOPE）。各成分通过酰胺反应结合，核磁共振氢谱法和质谱法进行结构鉴定；PLL压缩的siRNA溶液水化脂质体薄膜后，得到siRNA-MEND。依次利用透射电镜、动态光散射法和超滤离心法，检测siRNA-MEND的形态、粒径电位以及包封率；体外酶解实验考察siRNA-MEND在血浆中的稳定性；采用MTT法和荧光标记法，考察siRNA-MEND对肝癌BEL-7402细胞

3、生长抑制和转染效率；利用K-Ras-siRNA-MEND对BEL-7402细胞转染，考察细胞侵袭转移和基因沉默。结果表明修饰物GA-PEG-Pp-DOPE成功合成；siRNA-MEND粒子呈光滑的球形，具有明显的脂质双分子层和指纹结构，其粒径分布范围为163.5±20.0nm，平均电位为0.614±0.05mV；MEND对siRNA的包封率为82.8%。酶解实验表明MEND可以保护siRNA免受血浆降解长达120h，是裸siRNA的40倍；修饰成分中的肽可以被MMP-2特异性降解。MEND的细胞毒性小，在MEND转染下细胞的生长平均生长率为87.03±4.65%，siRNA-

4、MEND可以高效率的转染进入细胞质。由K-Ras-siRNA-MEND转染的细胞，其侵袭转移能力明显下降，K-Ras蛋白的表达水平比未转染细胞降低78.61倍。MEND的制备工艺简单，对siRNA具有较强的保护作用，可以明显延长siRNA在血液循环中的时间，转染效率较高。硕士研究生魏海田（药剂学）指导教师孙勇教授关键词：肝靶向；多功能信封式纳米装置；SiRNA；甘草次酸；转染AbstractWepreparedandevaluatedamultifunctionalenvelope-typenanodevice（MEND）asaliver-targetingandlong-c

5、irculationcarrierforsiRNA.MENDisakindofcompositelipidnanoparticleswhichcanimprovetheefficiencyoftransfectiontoo.Apolymer,GA-PEG-Pp-DOPE,structureofMEND,wassynthesizedviamodifyingpolyethyleneglycol（PEG）withglycyrrhetinicacid（GA）,peptide（Pp）,dioleoylphosphoethanolamine（DOPE）.Thepeptideisasubs

6、trateofmatrixmetalloproteinase2（MMP-2）therein.1H-NMRandMSwaschosentoidentifytheGA-PEG-Pp-DOPE.MENDwaspreparedwithGA-PEG-Pp-DOPEandcationicphospholipidsviafilming-rehydrationmethod.ThequalityofMENDparticleswereevaluatedbyshape,particlesize,electricpotential,encapsulationefficiency（EE）andstab

7、ilityinserumthroughtransmissionelectronmicroscope（TEM）,zeta-sizernanoinstrument,ultrafiltrationcentrifugationandenzymatichydrolysisexperiment.WestudythecellgrowthinhibitionrateandtransfectionefficiencyofsiRNA-MENDwithlivercancercells.K-ras-siRNA-MENDwasc