整合PD-L1单链抗体的融合蛋白的制备及其抗肿瘤活性的验证

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1、分类号密级学校代码103672015703108UDC编号学号0整合PD-L1单链抗体的融合蛋白的制备及其抗肿瘤活性的验证PreparationofFusionProteinofPD-L1Single-chainAntibodyandVerificationofItsAntitumorActivity论文类别：学术研究型作者姓名秦中强指导教师姓名谈燚副教授申请学位级别硕士学位授予单位蚌埠医学院学科专业外科学研究方向肝胆胰腺肿瘤论文答辩时间2018年5月学位授予日期2018年6月答辩委员会主席：论文评阅人：2018年5月硕士学位论文整合PD-L1单链抗体的融合蛋白的制备及

2、其论文题目：抗肿瘤活性的验证PreparationofFusionProteinofPD-L1Single-chainAntibodyandVerificationofItsAntitumorActivity研究生姓名:秦中强指导教师:谈燚副教授学科专业:外科学研究方向:肝胆胰腺肿瘤论文工作时间:2016年4月至2017年7月学位论文独创性声明本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成果。本论文中除引文外，所有实验、数据和有关材料均是真实的。本论文中除引文和致谢的内容外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的研究成果。其他同志对本研究

3、所做的贡献均已在论文中作了声明并表示了谢意。学位论文作者签名：日期：学位论文使用授权声明研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属蚌埠医学院。学校有权保存本学位论文的电子和纸质文档，可以借阅或上网公布本学位论文的部分或全部内容，可以采用影印、复印等手段保存、汇编本学位论文。学校可以向国家有关机关或机构送交论文的电子和纸质文档，允许论文被查阅和借阅。（保密论文在解密后遵守此规定）保密论文注释：本学位论文属于保密论文，密级：_____保密期限为_____年。学位论文作者签名：导师签名：日期：日期：目录1中文摘要…………………………………………………….12英文摘要………

4、…………………………………………….23论文正文前言……………………………………………………….4材料方法………………………………………………….8结果………………………………………………………22讨论………………………………………………………294结论………………………………………………………..325参考文献……………………………………………………336致谢……………………………………………………..…377附录附录A英中文术语缩略语对照表………………………………38附录B常用试剂配制……………………………………...…39附录C个人简历及发表论文………………………

5、……….….41附录D综述……………………………………………..….42整合PD-L1单链抗体的融合蛋白的制备及其抗肿瘤活性的验证中文摘要目的：利用酵母表面递呈技术，通过人PD-L1蛋白筛选人源单链抗体文库，获得识别人PD-L1蛋白的单链抗体的核苷酸序列。我们选用scFv-mFc融合蛋白的方式，并采用pFuse真核表达载体来表达此scFv-mFc融合蛋白，研究其对人肝癌细胞(HepG2)的亲和力和体内外抑制作用。方法：采用基因工程的方法构建重组质粒pFuse-scFv，通过真核转染至293F(人胚肾上皮细胞)，使用无血清Pro293a-CDM培养72h，收集培养液中分泌

6、的融合蛋白，运用免疫组化检测scFv-mFc融合蛋白与人肝癌细胞（HepG2）的结合；流式细胞术分析融合蛋白和人肝癌细胞的亲和力；ADCC实验测定融合蛋白对人肝癌细胞体外杀伤作用；利用接种人肝癌细胞的荷瘤小鼠对融合蛋白的体内抗肿瘤效应进行研究。结果：通过重组质粒转染至293F细胞的方法，scFv-mFc融合蛋白被分泌到无血清的培养液中；免疫组化和流式细胞术结果示，融合蛋白与表面高表达PD-L1蛋白的人肝癌细胞有较强的结合能力；ADCC实验结果示融合蛋白对肝癌细胞的杀伤作用；荷瘤小鼠实验结果示融合蛋白对肿瘤的生长起到抑制作用，在5mg/Kg的药物剂量下，荷瘤小鼠瘤体体积平

7、均增长率从14.90%降低至3.72%，两独立样本t检验P<0.05，差异具有统计学意义。结论：成功制备了含单链抗体的融合蛋白，其对人肝癌细胞（HepG2）具有良好的结合能力，在动物实验及细胞实验中均证明对肿瘤细胞产生抑制作用，为研制靶向抗肿瘤药物提供实验室基础依据。关键词：重组载体；PD-L1；单链抗体；融合蛋白；免疫抑制基金项目：安徽省教育厅自然科学基金重点项目(KJ2012A197)1PreparationofFusionProteinofPD-L1Single-chainAntibodyandVerificationofItsAn