硫化氢对pc12细胞自噬和α-synuclein降解的调控作用及分子机制

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1、论文题目硫化氢对P(12细胞自噬和a琴—降解的调控作用及分子机制胡丽芳—帕金森病的基础研究论文提交日期2015年4月苏州大学学位论文独创性声明本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得苏州大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的法律责任。论文作者签名；^ilb期：^/呤/•苏州大学学位论文使用授权声明本人完全了解苏州大学关于收集、保存和使用学位论文的规定，即

2、：学位论文著作权归属苏州大学。本学位论文电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。苏州大学有权向国家图书馆、中国社科院文献信息情报中心、中国科学技术信息研究所（含万方数据电子出版社)、中国学术期刊（光盘版）电子杂志社送交本学位论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借阅，可以釆用影印、缩印或其他复制手段保存和汇编学位论文，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索。涉密论文口本学位论文属在年—月解密后适用本规定。非涉密论文>论文作者签名：本日期：…崎"7导师签名；曰期：M丨叫”硫化氢对PC12细胞自噬和α-synuclein降解的调控作用及分子机制中文摘要硫化氢对

3、PC12细胞自噬和α-synuclein降解的调控作用及分子机制中文摘要目的：研究气体信号分子硫化氢对PC12细胞自噬和α-synuclein的降解调控作用，并探讨相关分子机制。方法：以高分化PC12细胞为工具细胞；用环境毒素鱼藤酮建立帕金森病细胞模型；分别以硫氢化钠（Sodiumhydrosulfide,NaHS）和GYY4137为硫化氢的速释和缓释供体。用MTT法检测细胞活力；Westernblot方法检测自噬底物蛋白SQSTM1/p62（sequestosome-1）、微管相关蛋白1轻链3（microtubule-associatedprotein1lightch

4、ain3,LC3）、非mTOR依赖通路蛋白Beclin1、mTOR依赖通路及上游激酶AMPK、mTOR和p70S6K及其磷酸化水平、以及α-synuclein的蛋白表达变化；使用NP40法进一步分离可溶和不可溶性α-synuclein；运用反转录PCR（reverse-transcriptionPCR,rt-PCR）方法检测α-synuclein的转录水平；瞬时转染GFP-LC3质粒，荧光显微镜观察硫化氢处理后LC3点状荧光表达分布的变化；BiotinSwitchTechnique（BST）检测AMPK的硫巯基化（S-sulfhydration）变化。结果：（1）以50

5、、100和200μMNaHS作用于PC12细胞24h，LC3II蛋白水平升高，而p62蛋白表达下降，其中100μMNaHS作用最为显著，与空白对照组相比具有统计学差异；以25、50和100μMGYY4137作用后，LC3II和p62蛋白表达出现类似变化，GYY4137在50μM时作用最为显著，与对照组相比具有统计学差异。而且，100μMNaHS和50μMGYY4137作用24h，均使得转染了GFP-LC3的PC12细胞LC3II点状聚集数目增加。上述剂量范围的NaHS和GYY4137作用24h，对细胞活力无明显影响。（2）NaHS和GYY4137作用后，Beclin1蛋

6、白水平并无明显改变；然而，100μMNaHS能够抑制mTOR及其下游底物p70S6K的磷酸化，而升高其上游激酶I中文摘要硫化氢对PC12细胞自噬和α-synuclein降解的调控作用及分子机制AMPK的磷酸化水平，50μMGYY4137亦有此作用；此外，NaHS能够显著升高AMPK的S-sulfhydration修饰水平。（3）100nM鱼藤酮单独作用PC12细胞24h后，α-synuclein蛋白水平明显升高，其中NP40不可溶部分α-synuclein约增加3倍，NaHS预处理能显著减少鱼藤酮诱导的α-synuclein的蓄积，而RT-PCR结果显示鱼藤酮和NaHS

7、单独作用对α-synuclein的mRNA水平均无显著影响。（4）NaHS预处理能显著减少鱼藤酮所引起的p62升高和LC3下降，提示硫化氢可能通过上调自噬水平、促进α-synuclein的自噬性降解而减少其在细胞内的蓄积。结论：在一定的剂量范围内，硫化氢通过S-sulfhydration修饰促进AMPK磷酸化增加、抑制mTOR/p70S6K活性而上调PC12细胞内的自噬活性，减少α-synuclein在胞内的蓄积。关键词：硫化氢；自噬；α-synuclein；帕金森病；硫巯基化修饰作者：李倩指导老师：胡丽芳副教授II硫化氢对PC12细胞自