脂肪干细胞生物学特性及参与脊髓损伤修复研究

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1、分类号密级ＵＤＣ号编博去学位论文脂肪干细胞生物学特性及参与脊髓损伤修复研究－Ｂｃｈａ－ｉｏｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ民ｅ化ａｒｃｈｏｆＡ出ｏｓｅＤｅｒｉｖｅｄＭｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｐＳｈｍＣｅｌｌｓａｎｄＡｌｉｃａｔｉｏｎｉｎＳｉｎａｌＣｏｒｄＩｎｕｒｙｐｐｐｊ赵勇导师姓名陈建庭教授专业名称外科学（骨科）培养类型学术型论文提交日期２０１５年３月１８日？．．．，■－■—．，‘－ｖ：；南方医科大学２０口级博壬学

2、位论文脂肪干细胞生物学特性及参与脊髓损伤修复硏究－Ｂ－ｉｏｃｈａｒａｃ化ｒｉｓｔｉｃｓＲｅｓｅａｒｃｈｏｆＡｄｉｐｏｓｅＤｅｒｉｖｅｄＭｅｓｅｎｃｈｍａｌＳｔｅｍＣｅｌｌｓａｎｄＡｌｉｃａｔｉｏｎｉｎｙｐｐＳｐｉｎａｌＣｏｒｄＩｎｕｒｊｙ课题来源：自选学位申请人赵勇导师姓若陈建庭教授专业違称外科学（骨科）培养类型学术型培养层次博去研究生所在学院南方医科大学２０１５年３月１８日广州博去学位论文＇脂肪干细胞生物学特性及参与替髓损伤修复研究博±研

3、究生；赵勇指导教师；陈建庭摘要第一章小鼠脂肪干细胞生物学特性研究一背景：干细胞研究在世界范围巧掀起了股热潮，因干细胞具有增殖与分化的特性，所Ｗ受到越来越多研究者的关注。在诸多成体干细胞的研究中，脂肪干细胞由于其独特的优势，在组织工程学领域逐渐突显出来。目的：通过体外分离培养获得小鼠腊肪干细胞系，了解其生物学特性，并为后续研究提供实验材料。方法；Ｗ１５只成年昆明系小鼠腹部皮下及腹股沟处脂肪组织为材料，Ｉ型‘Ｃ胶原酶巧条件下消化１ｈ获得脂肪干细胞。筛选培养体系对脂肪干细胞进巧体外培养，应用免疫组

4、化鉴定小鼠脂肪干细胞表面标志物，分析小鼠脂肪干细胞体外扩増情况，分析脂肪干细胞在体外培养时的染色体核型变化。结果：１５只成年昆明系小鼠，分离获得１２个小鼠脂肪干细胞珠，原代细胞开始培养时，细胞短小，呈圆形或卵圆形，胞体折光度高，２４小时后可见培养板有少量细胞贴壁，４８小时后贴壁细施数量大大增多，待长满培养板趋于融合时，细胞变得细长呈纺键形，形态为长梭形。经过１２０天的培养并对细胞生长情况进行记录＂，发现小鼠脂肪干细胞的生长曲线呈典型的可型，ＰＤＴ分别为４２．１４ｈｒ，４６．３２ｈｒ和４３．３４ｈｒ。细胞增殖过程

5、经历了潜伏期、对数生长期和平Ｉ摘要台期，说明小鼠脂肪干细胞具有较强的自我更新能力，易于进行体外扩增培养。在体外长期培养时，小鼠脂肪干细胞的衰老水平很低，在２５代１＾内基本没有明显衰老现象；在传至３０代时，只有不到５％的细胞表现出衰老现象，传至３５代时也仅有不到１５％的细胞表现出衰老现象。脂肪干细胞进行免疫组化鉴定：显示ＣＤ１３，ＣＤ２９，ＣＤ４４，ＣＤ７１，ＣＤ７３，ＣＤ９０，ＣＤ１０５和ＣＤ１６６呈阳性表达，－２ＧＦＡＰ和Ｎｅｓｔｉｎ呈阴性表达－ＭＡＰ。ＭＡＰ２ＧＦＡＰ和Ｎｅｓｔｉｎ

6、为神经相关细，，胞标志物，说明脂肪干细胞不表达神经样细胞相关蛋白。小鼠脂肪干细胞二倍＝体染色体数目为２ｎ４０，包括１９对常染色体和１对性染色体，性染色体为或Ｙ。结论：本实验所分离的小鼠脂肪干细胞在体外培养条件下扩增能力强，传代后细胞增殖速度快，细胞形态良好，衰老水平很低，且未见向神经系统分化，为后期神经细胞诱导和脊髓损伤修复提供了宝贵实验材料。第二章小鼠脂肪干细胞诱导分化为神经样细胞的研究：之前相关的研究认为背景，神经细胞在神经系统内产生后，很短的时间内就不会在产生新的神经细胞。这说明成年动物大脑和脊髓

7、内部的神经细胞是呈现逐渐减少的趋势，这些神经细胞不能够进行再生和自我更新甚至不能够替代。后天出现的神经系统损伤，例如大脑损伤和脊髓损伤，神经系统就不能进行自我替代修复。干细胞来源的神经细胞作为新的神经细胞供体，为神经细胞损伤修复带来新的曙光。；通过体外诱导小鼠脂肪干细胞定向分化为神经样细胞目的，为脊髓损伤细胞治疗提供种子细胞。方法２；取第３代培养的小鼠脂肪干细胞，按ＳｘｌｏＶｍＬ细胞浓度接种于２５ｃｍ规格的培养瓶中。加入含有２０ｎｇ／ｍｌｂＦＧＦ、２０ｎｇ／ｍｌＥＧＦ和２％Ｂ２７的培养基，‘

8、放置于３７Ｃ、５％Ｃ０２培养箱中继续进行培养。每隔３天，进行半量更换培养－。５７液于第天时就可Ｗ看见有类神经样细胞出现，此时进行免疫巧光染色和ＲＴ－ＰＣ民鉴定分析ｎｅｓｔｉｎ。之后对