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时间:2019-03-20
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1、分类号密级UDC号编博去学位论文脂肪干细胞生物学特性及参与脊髓损伤修复研究-Bcha-ioracteristics民e化archofA出oseDerivedMesenchymalpShmCellsandAlicationinSinalCordInurypppj赵勇导师姓名陈建庭教授专业名称外科学(骨科)培养类型学术型论文提交日期2015年3月18日?...,■-■—.,‘-v:;南方医科大学20口级博壬学
2、位论文脂肪干细胞生物学特性及参与脊髓损伤修复硏究-B-iocharac化risticsResearchofAdiposeDerivedMesenchmalStemCellsandAlicationinyppSpinalCordInurjy课题来源:自选学位申请人赵勇导师姓若陈建庭教授专业違称外科学(骨科)培养类型学术型培养层次博去研究生所在学院南方医科大学2015年3月18日广州博去学位论文'脂肪干细胞生物学特性及参与替髓损伤修复研究博±研
3、究生;赵勇指导教师;陈建庭摘要第一章小鼠脂肪干细胞生物学特性研究一背景:干细胞研究在世界范围巧掀起了股热潮,因干细胞具有增殖与分化的特性,所W受到越来越多研究者的关注。在诸多成体干细胞的研究中,脂肪干细胞由于其独特的优势,在组织工程学领域逐渐突显出来。目的:通过体外分离培养获得小鼠腊肪干细胞系,了解其生物学特性,并为后续研究提供实验材料。方法;W15只成年昆明系小鼠腹部皮下及腹股沟处脂肪组织为材料,I型‘C胶原酶巧条件下消化1h获得脂肪干细胞。筛选培养体系对脂肪干细胞进巧体外培养,应用免疫组
4、化鉴定小鼠脂肪干细胞表面标志物,分析小鼠脂肪干细胞体外扩増情况,分析脂肪干细胞在体外培养时的染色体核型变化。结果:15只成年昆明系小鼠,分离获得12个小鼠脂肪干细胞珠,原代细胞开始培养时,细胞短小,呈圆形或卵圆形,胞体折光度高,24小时后可见培养板有少量细胞贴壁,48小时后贴壁细施数量大大增多,待长满培养板趋于融合时,细胞变得细长呈纺键形,形态为长梭形。经过120天的培养并对细胞生长情况进行记录",发现小鼠脂肪干细胞的生长曲线呈典型的可型,PDT分别为42.14hr,46.32hr和43.34hr。细胞增殖过程
5、经历了潜伏期、对数生长期和平I摘要台期,说明小鼠脂肪干细胞具有较强的自我更新能力,易于进行体外扩增培养。在体外长期培养时,小鼠脂肪干细胞的衰老水平很低,在25代1^内基本没有明显衰老现象;在传至30代时,只有不到5%的细胞表现出衰老现象,传至35代时也仅有不到15%的细胞表现出衰老现象。脂肪干细胞进行免疫组化鉴定:显示CD13,CD29,CD44,CD71,CD73,CD90,CD105和CD166呈阳性表达,-2GFAP和Nestin呈阴性表达-MAP。MAP2GFAP和Nestin
6、为神经相关细,,胞标志物,说明脂肪干细胞不表达神经样细胞相关蛋白。小鼠脂肪干细胞二倍=体染色体数目为2n40,包括19对常染色体和1对性染色体,性染色体为或Y。结论:本实验所分离的小鼠脂肪干细胞在体外培养条件下扩增能力强,传代后细胞增殖速度快,细胞形态良好,衰老水平很低,且未见向神经系统分化,为后期神经细胞诱导和脊髓损伤修复提供了宝贵实验材料。第二章小鼠脂肪干细胞诱导分化为神经样细胞的研究:之前相关的研究认为背景,神经细胞在神经系统内产生后,很短的时间内就不会在产生新的神经细胞。这说明成年动物大脑和脊髓
7、内部的神经细胞是呈现逐渐减少的趋势,这些神经细胞不能够进行再生和自我更新甚至不能够替代。后天出现的神经系统损伤,例如大脑损伤和脊髓损伤,神经系统就不能进行自我替代修复。干细胞来源的神经细胞作为新的神经细胞供体,为神经细胞损伤修复带来新的曙光。;通过体外诱导小鼠脂肪干细胞定向分化为神经样细胞目的,为脊髓损伤细胞治疗提供种子细胞。方法2;取第3代培养的小鼠脂肪干细胞,按SxloVmL细胞浓度接种于25cm规格的培养瓶中。加入含有20ng/mlbFGF、20ng/mlEGF和2%B27的培养基,‘
8、放置于37C、5%C02培养箱中继续进行培养。每隔3天,进行半量更换培养-。57液于第天时就可W看见有类神经样细胞出现,此时进行免疫巧光染色和RT-PC民鉴定分析nestin。之后对
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