应用反向遗传操作系统研究鹅源新城疫病毒np基因5'非编码区六个核苷酸对病毒毒力的影响

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1、中文摘要应用反向遗传操作系统研究鹅源新城疫病NP基因5`非编码区六个核苷酸对病毒毒力的影响新城疫是由新城疫病毒引起的一种具有高度传染性的疾病，严重影响着野生的鸟类健康以及养禽业的发展并导致大量的经济损失。从19世纪二十年代新城疫病毒首次出现至今，该病毒已经造成了四次世界大流行，高致病性的新城疫已经在世界范围内快速扩散。最近一次的新城疫大流行被认为是由1980至1990年间出现的新城疫病毒基因VII型和基因VIII型引起的。几十年来，人们认为新城疫病毒并不感染水禽和哺乳动物，但是，上个世纪90年代，新城疫病毒感染水禽的报道频繁出现于中国。例如，对鹅

2、具有高致病性的基因VII型新城疫病毒NA-1株在中国的吉林省的鹅群中被分离到。具有毒力的新城疫病毒株依旧可以频繁的从免疫过的禽类中分离到，这一事实说明，新城疫的防控存在一定问题。目前，在我国鹅群中广泛流行的新城疫病毒是基因VII型新城疫病毒，鹅群中所用的预防新城疫病毒的疫苗株是B1，clone30，Lasota和V4属于基因II型和基因I型，与目前流行于鹅群的新城疫病毒相比，疫苗株与流行株分属于不同的基因型，新城疫病毒流行株与疫苗株之间的抗原差异可能会解释在免疫过的禽类中新城疫还会爆发的原因。为了预防和控制鹅源新城疫，通过降低新城疫病毒的毒力创制

3、弱毒同源疫苗是很有必要的。虽然新城疫病毒F蛋白裂解位点的氨基酸序列是决定新城疫病毒毒力的主要因素，但是新城病毒中的其他基因也会对病毒的毒力产生影响。例如在对犬瘟热病毒和新城疫病毒的研究过程中，转录和转译调控信号通过控制蛋白的表达进而影响病毒的毒力。人们根据新城疫病毒基因组的特征将其分为ClassI和ClassII两个组，其中ClassII包括15186bp和15192bp两个长度，本实验所用NA-1株的基因组长度为15192bp基因VII型新城疫病毒，与Lasota为代表的基因II型，基因组长度为15186bp的新城疫病毒相比，NA-1株在其NP

4、基因5′非编码区1648至1653核苷酸处有6个高度保守的核苷酸的插入，I所以我们想了解，这6个核苷酸的差异是否会影响病毒的毒力。在本实验中，NA-1株做为亲本毒株，rNA-1(-)株是在NP基因5′非编码区1648至1653核苷酸处缺失6个核苷酸的毒株。我们将NA-1的基因组分成6个部分，分别命名为A，B，C，D，E和F，设计6对引物分别扩增这6段基因，并将它们分别克隆于pMD18-T克隆载体中，然后将这6段基因依次连接到修饰过的pBR322克隆载体中，经测序鉴定后，NA-1株全长感染性克隆构建完成，命名为pAF。为了研究6个核苷酸与病毒毒力的

5、关系，我们进行了包含缺失NP基因5′非编码区1648至1653位点6个核苷酸的NA-1株全长感染性克隆的构建。以上述构建好的A片段克隆（T-A）为基础，通过PCR的方法对A片段上的NP基因5′非编码区1648至1653位点6个核苷酸进行敲除，将敲除成功的A片段命名为T-A(-)。通过SalI和AgeI内切酶，将T-A(-)与pAF中的相同部分进行替换，进而构建包含缺失位点的NA-1株全长感染性克隆,命名为pAF(-)。最后，我们将上述两种构建完成的病毒基因组与辅助质粒分别转染表达T7RNA聚合酶的BHK细胞中，进行病毒的拯救。转染后5至6d，我们

6、得到了病毒颗粒并对其进行了鉴定。虽然rNA-1(-)生长曲线与其亲本毒很相似，但是在进行病毒毒力的实验中，我们发现rNA-1(-)的毒力降低了，具体表现在鸡胚平均死亡时间的增加以及脑内致病指数的降低。实验结果显示，NP基因5′非编码区1648至1653位点6个核苷酸在降低鹅源新城疫病毒NA-1株毒力方面有一定贡献。控制和预防新城疫具有非常重要的流行病学意义，解决这个问题的一种方法是高效，安全的同源疫苗的创制。然而，目前没有用于预防基因VII型鹅源新城疫病毒的商业化疫苗。因此，我们着手建立的反向遗传操作系统，不但可以研究病毒基因的功能，筛选同源疫苗

7、弱毒候选株，而且还可以优化表达外源基因的新城疫病毒载体，进而为新城疫病毒同源的疫苗的创制奠定基础。关键词：鹅，新城疫病毒，反向遗传学，病毒毒力IIAbstractTheReseachofSixNucleotidesinthe5′UntranslatedRegionoftheNPGeneAffecttheVirulenceofGooseNewcastleDiseaseVirusNA-1StrianUsingReverseGeneticSystemNewcastledisease(ND)causedbyNewcastlediseasevirus(ND

8、V)isacontagiousdiseaseaffectingwildbirdsanddomesticpoultrythatfreque