新城疫病毒jl022000株全基因组克隆与反向遗传辅助系统的构建

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1、分类号：S855.3单位代码：10193密级：公开学号：2012651硕士学位论文新城疫病毒JL02/2000株全基因组克隆与反向遗传辅助系统的构建TheconstructionofplasmidcloningsystemofNewcastlevirusJL02/2000andthehelpersystem作者姓名：陈兴学位类别：农学硕士专业名称：预防兽医学研究方向：动物病原学指导教师：赵权所在学院：动物科学技术学院年月独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立进行研究所取得

2、的成果。尽我所知，除文中特别加以标注和致谢所列内容外，论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得吉林农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。本学位论文所有内容若有不实之处，本人愿意承担一切相关法律责任和后果。学位论文作者签名：签字日期：年月日关于学位论文使用授权的声明1、本人完全了解吉林农业大学有关保留和使用学位论文的规定，即：研究生在校攻读学位期间所完成的论文及相关成果的知识产权属

3、吉林农业大学所有，并同意将本论文的版权授权给吉林农业大学，学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。2、本人（同意/不同意，务必打印后填写）吉林农业大学将本论文版权授权给不同媒体进行电子出版、多媒体出版、网络出版以及其他形式出版（涉密学位论文解密后应遵守此协议）。3、本人声明毕业后若发表在攻读研究生学位期间完成的论文及相关的学术成果，必须以吉林农业大学作为第一署名单位。学位论文作者签名：签字日期：年月日指导教师签名：签字日期：年

4、月日吉林农业大学硕士学位论文摘要新城疫（ND）是一种高致病的禽类恶性传染病。由于其高发病率和高死亡率对社会生产造成巨大经济损失。而近些年，随着反向遗传学操作系统的发展，其为系统的操作和研究RNA病毒提供了操作平台，该方法可以重新设计和优化病毒的基因组，还可以研发新的突变体和重组病毒疫苗。NDV的反向遗传操作平台为研究其生物学特点具有重大意义，而其复制必须同时共转染多个辅助质粒，并在T7RNA聚合酶调控下转录、翻译后形成RNP核糖核蛋白复合体，包裹病毒全基因组，从而开始病毒复制程序。本实验以BL-2

5、1大肠杆菌为模板应用PT-PCR方法获得T7基因，之后通过分子生物学方法构建了稳定表达T7RNA聚合酶的重组痘苗病毒，用于提供T7RNA聚合酶；构建了辅助质粒pCI-L、pCI-NP和pCI-P三个辅助质粒形成RNP复合体；应用SOE-PCR（重叠延伸PCR）方法基础上构建了4961bp的基因组起始基因片段ND1，由于ND1片段较大，所以自制T载体pCI-T，成功克隆了ND1片段；构建了转移质粒pBSK-0-1-2-3以及真核表达质粒pBR322-ND5。完成了新城疫JL02/2000株反向遗传辅

6、助系统的建立以及基因组克隆。关键词：新城疫病毒；反向遗传；重叠PCR；T载体；重组痘苗病毒。I吉林农业大学硕士学位论文AbstractNewcastledisease(ND)isahighlypathogenicviraldiseaseofavianspecies,whichiseconomicallysignificantasaresultofthehugemortalityandmorbidity.Thedevelopmentofreversegeneticssystemsformanipul

7、ationandstudyofRNAvirusgenomeshaveprovidedplatformsfordesigningandoptimizingviralmutantsforvaccineresearch,whichmakesgreatsignificancetostudybiologicalcharacteristics.Whileitsauxiliaryplasmidreplicationmustbetransfectedmorethantwoplamidsatthesametime,

8、andthen,undertheregulationofT7RNApolymerase,RNPribonucleoproteincomplexisformedaftertranscription,translation,andthefinalpackagingofvirusgenome.Afterthat,thevirusbeginstoreplicatetoproducenext-generationvirus.Thisexperimentbuiltastableexpressi