禽传染性支气管炎病毒M_41株反向遗传株的构建.pdf

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1、基础科学中国畜牧兽医文摘2015年31卷第5期禽传染性支气管炎病毒M4株反向遗传株的构建李然许记刚吴暄姬高升杨鑫王红宁(四川大学生命科学学院，动物疫病防控与食品安全四川省重点实验室，生物资源与生态环境教育部重点实验室，“985工程”西南资源环境与灾害防治科技创新平台，四川成都610064)[摘要]禽传染性支气管炎病毒是目前危害禽养殖业的重大传染病之一。由于病毒基因组大、操作困难，给研究其基因组结构开发有效的疫苗带来了困难。本研究在对IBVM41毒株全基因组序列测序的基础上用DNAStar软件的MapDraw程序分析酶切位

2、点的分布情况，将全基因组分为14段分段扩增。采用Primer6设计含NoSee’m酶切位点，在5’端引入T7启动子核心序列的引物，分段克隆于PMD19-T载体，通过引入的“NoSee’m式”BsaI和BsmBI酶切位点，将亚克隆体外拼接成基因组全长eDNA。再通过5’端引入的T7启动子核心序列对基因组全长cDNA进行体外转录，使用电击的方法将全长转录物转染BHK-21细胞，转染后转J'~SPF鸡胚培养，鉴定成功获得了IBVM拯救株。为研究IBV强毒株的致病机理、毒力位点及IBV新型疫苗的研究提供了参考，奠定了基础。[关键

3、词]IBVM41株反向遗传传染性支气管炎(IB)又称为禽传染性支气管炎，是由冠状1材料病毒科的传染性支气管炎病毒(hfectiousbronchitisVirus，IBV)1．1毒株引起的一种鸡的常见的急性、高度传染性疾病，是危害养禽业IBVM41株中国兽医药品监察所提供，由四川大学动物疫病的重大传染病之一。以呼吸道症状、产蛋鸡产蛋下降、蛋品质防控与食品安全四川省重点实验室保存。下降、肾脏病变及胃肠道病变为主要特征(SaifYM等，2005；1．2工具酶及主要试剂Cavanagh等，2003)。目前，IBV广泛分布，不同

4、毒株在组织嗜限制性内切酶BSaI、BsmBI(NEB)；KOD—plus高保真酶性及致病性上存在较大差异，血清型复杂，目前全世界已经发(TOYOBO)；PMD19一T、DH5、T4DNALigase(Takara)；现几十种IBV血清型，由于血清型众多，不同血清毒株交叉保护引物由上海生工生物公司合成。弱，新的变异毒株不断出现，导致禽传染性支气管炎不断爆发2方法(ZouNL等，2010；KulkarniAB等，2010)。每年造成的经济2．1IBVM株全基因组的分段扩增损失超过十亿元，当前尚无治疗IB的特效药，疫苗免疫成为

5、IBV在对IBVM41毒株全基因组测序的基础上，用DNASTAR对其防控的主要手段(王红宁，20o0)。进行酶切位点的分析后将全基因组分成14段。用Primer62计含有对RNA病毒而言，反向遗传学技术主要指全长cDNA感染性NoSee’m酶切位点的扩增引物，在全基因组5’UTR端引入T7启动克隆技术，包括病毒基因组全长cDNA的克隆拼接技术和由全长子，在全基因组3’端引人Poly(A)尾。引物由上海生工生物T程cDNA转录获得感染性转录体制备技术。该技术能在病毒DNA水平公司合成。上对其进行人工操作，解决了RNA病毒基

6、因组难以操作的难题，Trizol法从含IBVM41株的鸡胚尿囊液中提取总RNA，反转从而为RNA病毒的基因复制与表达调控机理研究，新疫苗的研制录成cDNA，14个片段分别用高保真酶以cDNA为模板进行PCR扩等提供了强有力的技术手段。自1978年Taniguchil首次对RNA病毒增。将各个目的片段纯化后分别与PMD19一T载体连接、将获得的噬菌体QB进行反向遗传操作(TaniguehiandWeissmann，1978)连接产物转化到DH50[感受态中，在含有氨苄西林的IPTG／X—gal以来，已有大量RNA病毒反向遗

7、传操作的报道。禽冠状病毒传染固态平板上37~C过夜培养，挑取阳性克隆(3～5个)进行测序正性支气管炎病毒IBV的反向遗传操作主要集中在Beaudette株反向确无误后保存菌种。遗传研究。CasalsR等(2001)痘苗病毒载体成功建立了IBV反向2．2重组质粒的提取、目的cDNA片段的酶切回收遗传操作技术，发现S蛋白是IBV组织嗜性的决定子，也是主要免将鉴定后保存的正确无误的菌种接种于200ml具有氨苄抗性的疫原性基因。CasalsR等(2005)发现基因5是IBV复制非必需的基LB培养基中37℃过夜培养11～14h，用

8、碱裂解法提取质粒、用聚因。HudgsonT等(2006)在Casals前期的工作基础上，对IBV的基乙二醇法纯化。因3(3ab)的功能进行了研究，结果发现基因3也是复制非必需的分别对载有F1～F14的质粒进行酶切，将酶切产物进行琼脂基因。美国学者Youns等(2005)和新加坡学者Fangs等(2007)糖凝胶电泳，