试析脂肪酶构象刻录及催化能力考察

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1、浙江大学硕士学位论文Y846116申请浙江大学工学硕士学位脂肪酶构象刻录及催化能力考察作者姓名龚伟指导教师宋锡瑾副教授学科专业化学工艺浙江大学材料与化工学院二00六年二月浙江大学硕士学位论文摘要本文首次阐述了一种新型固定化酶——“刻录酶”的制备方法。和普通固定化酶相比，首先，它在制备过程中加入了配体诱导酶构象；其次，最终制备得到的刻录酶构象是刚性化的。文中对刻录酶的整个制备流程进行了摸索，重点讨论了它在水相和有机相中的催化活性、稳定性以及在有机相中的吸附配体能力，最后利用SEM对刻录酶载体进行了宏观表

2、征。以聚乙二醇200(400)二(甲基)丙烯酸酯4种不同的功能单体和三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯为聚合原料，脂肪酶为模板分子，加入配体月桂酸对脂肪酶进行活性构象诱导，再通过紫外光引发聚合以及无水有机溶剂索式抽提月桂酸后，获得了4种锁定脂肪酶活性构象的聚合物，即刻录脂肪酶聚合物。在以无水丙酮为洗脱剂时获得了最高86．31％的月桂酸洗脱率，且脂肪酶的洗脱量保持在一个较小范围。当单体和交联剂以质量比为2：l，紫外光照聚合时间为45s时，所得四种刻录酶都表现出了优异的抗溶胀稳定性，尤其在正庚烷和水中为最佳。这些

3、都基本符合对“刻录酶”载体性能的预期设想。论文对刻录酶在水相和有机相的催化特性进行了探索。水相催化采用橄榄油水解法，发现四种刻录酶都具有较好的活性和稳定性。它们在水相中最佳催化时间为15min，活性最大在Da(聚乙二醇400二丙烯酸酯为单体的刻录酶)上获得(6．07U／g)，活性收率高达171％；同时经过比较，发现含有甲基的单体聚合时容易形成超支化聚合物，增大反应时的传质阻力，造成其活性和活性收率都人大降低：四种刻录酶在强酸(pH=2．42)、强碱(pH一12．00)和高温(80℃)下均可以分别保持它

4、们初始活性的75％、50％和70％以上，其中Da在160。C左右完全失活，这是因为载体在153。C开始热不稳定造成的；用沉淀变性剂和溶解变性剂分别浸泡刻录酶30d后，四种刻录酶仍然可以表现出它们初始活性的50％和45％以上。这说明脂肪酶构象的高度刚性化对它在水相催化时的活性和稳定性都是非常有利的。有机相催化选用月桂酸和正丁醇的正庚烷酯化反应体系，以活性最大的Da为考察对象，发现它在有机相催化中活性较为低下。40。C时催化24h活性为15．30U／g，升温至50。C可以小幅度提升Da活性为16．67U／

5、g，而此时活性仅为固体酶粉的46．88％；但刻录酶优异的稳定性在有机相中继续得以体现。经过5浙江大学硕士学位论文次连续的循环抽提和催化反应后，刻录酶仍然可以残留91．04％的初始活性。在进一步研究中显示，通过加入致iL剂甲苯减少传质阻力的方法无法提升酶活性，因为甲苯容易使游离酶失活，而直接提高正庚烷中的含水量却可以大幅度提高酶活性。当正庚烷的水含量为I％(v，v)时刻录酶活性为最大，40。C时催化24h活性达38．23U／g，是无水时活性的2．49倍。但随着正庚烷中含水量的继续增加，刻录酶活性不断下降

6、，至10％(v／v)时完全失活。这说明水引发的刻录酶柔性对酶活性提高有至关重要的作用，保持脂肪酶活性构象的同时增加些许柔性可以获得最为理想的活性效果。40℃在水含量为1％(v／v)的正庚烷酯化体系中，刻录酶催化的酯化反应过程还基本符合双底物Ping—Pong理论所描述的反应动力学机制，其动力学方程可表示为V=五j五西2再0．3丁90丽[A丽]面[B]ij丽。实验还对Da的吸附配体能力做了考察。对月桂酸浓度为200gmol／mL的正庚烷溶液进行吸附，发现Da对配体月桂酸显示出了一定的吸附能力。在40。C

7、下它的平衡吸附量为30．22(mg·g“)，较30。0提高1．35倍，吸附收率为70．46％，此时的吸附速率常数为O．024(mg’g-1．min。)，吸附动力学行为符合Langmuir速率方程；加入致孔剂甲苯可以提高Da的月桂酸吸附量，40。C下平衡吸附量提高为40．04(mg·g。)，吸附收率达93．35％，此时的吸附速率常数为O．033(mg·g-1．min。1)，且吸附动力学行为也符合Langmuir速率方程。但和有机相催化不一致，水的加入不利于Da的吸附过程，在40。C，当正庚烷中含水量为0

8、．5％(v／v)时，Da的平衡吸附量下降1倍，至5％(v／v)时基本没有吸附能力。这说明水引发的刻录酶柔性改变了它的刚性吸附位点，减弱了吸附作用。最后通过SEM表面分析对Da载体进行了宏观表征。发现在Da载体断面和孔道内都有许多很细小的线状颗粒存在且分布非常均匀，其大小约为十个或几十个脂肪酶分子，而在表面却观察不到这些颗粒。推测这些线状的颗粒可能为脂肪酶分予的多聚体形式。关键词：脂肪酶；构象刻录；稳定性；分子印迹；生物印迹；吸附；SEMII浙江大学硕士学