熊果酸和齐墩果酸对胰脂肪酶活性及构象的影响的论文

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1、熊果酸和齐墩果酸对胰脂肪酶活性及构象的影响的论文作者：刘志芳，田萌，马跃文，李政，李黎，刘克武【摘要】　　目的研究熊果酸（ua）和齐墩果酸（oa）对胰脂肪酶（lps）活性和构象的影响。方法采用紫外光谱法、荧光光谱法以及圆二色谱法分析ua和oa作用后lps相应图谱的特征。结果ua和oa作用后lps的活性明显降低，紫外吸收光谱发生改变。荧光淬灭结果显示ua作用后，lps的荧光发生淬灭，且淬灭的机制为静态淬灭和动态淬灭组合的淬灭机制，而oa对lps荧光淬灭主要为静态淬灭；ua和oa作用后lps的圆而色谱图谱发生改变。结论ua和oa都可以抑制lps的活性、影响l

2、ps的构象，且ua对lps的构象影响及抑制作用更加显著。【关键词】熊果酸齐墩果酸胰脂肪酶紫外光谱荧光光谱圆二色谱　　脂肪酶(lipase，简称lps)是一种特殊的酯键水解酶，广泛存在于动物组织、植物种子和微生物体中，它能催化天然底物油脂水解，产生脂肪酸和甘油［1］。　　熊果酸(ursolicacid,ua)和齐墩果酸(oleanolicacid,oa)为同分异构体,均属于五环三萜类化合物,广泛存在于中草药中,且具有多种生物活性［2］。.oa和ua都具有一定的降脂作用，能够有效地降低高脂血症小鼠的血脂［3，4］，有望开发成新型降脂药。但oa和ua降脂作用的

3、强弱的比较及降脂作用机理尚未见报道。本文采用紫外光谱、荧光光谱和圆二色谱等方法，研究了ua和oa对lps活性及构象的影响，比较了ua和oa对lps抑制作用的强弱，为探寻oa和ua降脂作用机理，将其开发为一种双成分降脂新药提供理论参考。　　1仪器与试剂　　f-4500荧光光谱仪(日立)，tu-1800紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器公司），jasco-j-810圆二色谱仪(日本jasco公司)。齐墩果酸和熊果酸购自陕西森弗生物技术有限公司，胰脂肪酶购自sigma公司；其余试剂均为国产分析纯。　　2方法　　2.1ua，oa对lps活性的影响　　2.1.1

4、ua，oa对lps的抑制作用酶活性测定采用铜皂法［5］。　　2.1.2ua，oa对lps的抑制动力学研究　　在酶的反应体系中分别加入不同浓度的ua和oa，改变底物橄榄油的浓度，测定酶促反应的初速度。以linel浓度为1×10-5mol/l的lps溶液，分别加入不同微量体积的ua和oa（1.0×10-3mol/l）溶液，使三萜类小分子与lps的终摩尔比分别为0／1，0.2／1，0.4／1，0.6／1，0.8／1，1／1，3／1，5／1。混合均匀后，室温放置10min，以相同浓度的小分子溶液作空白，记录200～300nm的紫外吸收光谱。　　以295nm为激发

5、波长，室温下测定300～400nm的荧光光谱，溶液浓度及反应条件同上述。　　2.2.2圆二色(cd)谱测定　　样品池光程为0.1cm,在室温下测定波长范围190～250nm的cd谱。cd谱用平均残基摩尔椭圆度表示，单位为deg·cm2·mol-1，数据经3次扫描取平均值。得出cd谱后,用该仪器附带的杨氏方法软件计算脂肪酶的二级结构含量。lps浓度为1×10-5mol/l，实验时三萜类小分子与lps的终摩尔比为0／1，0.4／1，3／1。　　3结果与讨论　　3.1ua，oa对lps活性的影响　　不同浓度的ua，oa对lps活力的影响结果见图1。由图1可以看

6、出，ua，oa对lps都有一定的抑制作用，抑制作用随ua，oa浓度的升高而增强。在相同浓度下，ua的抑制作用大于oa。　　3.2ua，oa对lps的抑制　　动力学ua，oa对lps的抑制作用如图2。由图可知随着ua，oa浓度的升高，酶的km值保持不变，而vmax则随ua，oa浓度的升高而不断降低。因此ua、oa对lps均属于非竞争性抑制。　　采用dixon作图法，以1/v对不同浓度的ua，oa作图，可得到ua，oa的抑制常数ki。ua，oa的ki分别为0.6mmol/l，0.46mmol/l，可见抑制作用ua大于oa。　　3.3不同浓度ua，oa对lps

7、的紫外吸收差谱　　大多数蛋白质分子在280nm附近有一个吸收峰，是由于色氨酸(trp)和酪氨酸(tyr)等芳杂环对光的吸收；同时在220nm左右有一个由肽键的c=o的π-π跃迁引起的强吸收峰，与蛋白质的α-螺旋含量有关［7］。　　用不同浓度的ua，oa作用于lps的紫外吸收差谱如图3。可知lps在270nm和220nm附近出现最大吸收峰，且随ua、oa浓度的增加lps在220nm和270nm附近的吸收不断增大，图3a中最大吸收都有少许红移。在低浓度时，酶在220nm和270nm附近的吸收随浓度的增加而急剧增加，当ua与酶的比例达到1/1后，紫外吸收增幅减

8、慢。因此可以认为ua与lps的摩尔比例为1/1时，具有最大紫外吸收。图3b中oa