探索双底物诱导脂肪酶构象刻录的催化及吸附性能研究

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1、浙江大学硕士学位论文双底物诱导脂肪酶构象刻录的催化及吸附性能研究姓名：宣锋申请学位级别：硕士专业：化学工艺指导教师：宋锡瑾20070501浙江大学硕士学位论文摘要本文以脂肪酶为研究对象，结合分子印迹和生物印迹两种技术制备双底物刻录脂肪酶。在制备过程中利用底物诱导酶构象，然后利用高交联度聚合物对该构象进行刻录，最终制备出的刻录酶构象是刚性化的。本文重点研究了双底物刻录酶在水相和有机相中的催化活性、稳定性以及有机相中吸附配体能力，并考察了影响吸附能力的一些因素。本文采用四种不同的功能单体(聚乙二醇200(400)二(甲基)丙烯酸酯)和三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯为聚合原料

2、，并加入底物月桂酸和正丁醇对脂肪酶进行活性构象诱导，再经紫外光引发聚合、抽提和干燥后，获得了四种刻录脂肪酶聚合物。其中，选用石油醚作为抽提溶剂，单体和交联剂的质量比为2：1，紫外光照聚合时间为45s。本文对制备得到的双底物刻录酶进行水相和有机相中催化活性的测定。四种双底物刻录脂肪酶在水相催化中表现出较高的活性和稳定性，其中双底物刻录酶聚合物Da具有最高水相催化活性(3．710／g)，而且还发现含有甲基的单体聚合时容易增大刻录脂肪酶聚合物的空间位阻，从而增大了反应时的传质阻力，造成其催化活性比不含甲基的单体为原料聚合成的双底物刻录脂肪酶的催化活性低(Ba>Aa，Da>

3、Ca)。四种双底物刻录脂肪酶在pH=7．5和温度50"C～60℃时均表现出它们各自的最大催化活性，而且在强酸、强碱和高温环境下也可保持较高的催化活性；同样用沉淀变性剂和溶解变性剂分别浸泡20d后，它们的活性仍都保持在初始活性的50％以上。这表明双底物刻录脂肪酶聚合物在有变性剂存在的环境中也能保持较高的催化效率。有机相催化以选用月桂酸和正丁醇的正庚烷酯化反应体系，随着温度的升高，平衡催化转化率也随之提高，同时催化活性也逐步提高。但温度越高，平衡催化转化率和催化活性上升幅度越来越小。反应24h后，在60’C时，有机相双底物刻录酶聚合物Da的催化活性达到最大值(20．92

4、U／g)。本文还对双底物刻录酶Da的吸附能力做了考察。发现Da对配体月桂酸和正丁醇显示出了一定的吸附能力，其中还对温度、溶剂、双底物刻录酶聚合物浙江大学硕士学位论文Da中的含水量以及Da的催化活性等因素对Da吸附性能的影响作了考察。结果发现升温有利于双底物刻录酶Da对配体吸附能力的上升，在50℃下它的平衡吸附量为37．55(mg·百1)，但随着温度的进一步上升，吸附量增加不明显，甚至出现吸附量下降的情况；溶剂是通过对聚合物和配体的分子作用来影响两者之间的选择性和亲和力的；双底物刻录酶聚合物Da中含水量的增加导致其吸附能力大大减小；失活的双底物刻录酶聚合物Da对配体的

5、吸附能力明显下降：此外，双底物刻录酶聚合物上的空穴对配体来说并不是特定对应的，许多其它酸、醇类似物也能吸附到双底物刻录酶聚合物上。关键词：脂肪酶；生物印迹；分子印迹；构象刻录；催化活性；吸附lI浙江大学硕士学位论文AbstractThearticleisstudiedinlipaseandusetwonewtechnique—bioimprintingtechniqueandmolecularimprintingtechniquetopreparethedoublesubstratesrecordedlipase，Lipaseconformationcanbeind

6、ucedbysubstratetobeanactivatedoneinpreparationprocess．Thentheactivatedconformationwasrecordedusinghighcrosslinkingdegreepolymer．Andthefinalenzymeconformationisrigid．Thedoublesubstratesrecordedlipase’scatalyticcharacteristicinwaterandorganicsolvent，anditsadsorptioncapacitywereinvestigat

7、ed．Thedissertationemphasizesonexploringtheprocessofdoublesubstratesrecordedlipasepreparation．Lipase，laurieacidandn-butylalcoholwereaddedintoacopolymersystem，whichcontainedfourdifferent16ndsoffunctionmonomerandtrimethylolpropanetrimethacrylate．Thepolymerizationwasobtainedbyultraviolet