《不同精子质膜保护剂对猪精液常温保存效果的影响》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
分类号：S814.3学校代码：10712UDC：636.4研究生学号：2013050564密级：公开@^灶农林爷祆大学2015届全日制硕士专业学位研究生学位论文不同精子质膜保护剂对猪精液常温保存效果的影响类型农业推广硕士领域、方向_________养殖研究生_________刘琦指导教师胡建宏教授完成时间2015年5月中国陕西杨凌 研究生学位论文的独创性声明本人声明：所呈交的全日制颂士专业学位论文是我个人在导师指导下独立进行的研究工作及取得的研究结果；论文中的研究数据及结果的获得完全符合学校《关于规范西北农林科技大学研究生学术道德的暂行规定》，如果违反此规定，一切后果与法律责任均由本人承担。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究结果，也不包含其他人和自己本人已获得西北农林科技大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同事对本研究所做的任何贡献均已在论文的致谢中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：和福时间：％丨•^年么月丨日导师指导研究生学位论文的承诺本人承诺：我的全日制硕士专业学位研究生所呈交的硕士学位论文是在我指导下独立开展研究工作及取得的研究结果，属于我现岗职务工作的结果，并严格按照学校《关于规范西北农林科技大学研究生学术道德的暂行规定》而获得的研究结果。如果违反学校《关于规范西北农林科技大学研究生学术道德的暂行规定》，我愿接受按学校有关规定的处罚处理并承担相应导师连带责任。导师签名时间：>(>16月I曰 关于研究生学位论文使用授权的说明本学位论文的知识产权归属西北农林科技大学。本人同意西北农林科技大学保存或向国家有关部门或机构送交论文的纸质版和电子版，允许论文被查阅和借阅；同意西北农林科技大学将本学位论文的全部或部分内容授权汇编录入《中国优秀硕士学位论文全文数据库》进行出版，并享受相关权益。本人保证，在毕业离开（或者工作调离）西北农林科技大学后，发表或者使用本学位论文及其相关的工作成果时，将以西北农林科技大学为第一署名单位，否則，愿意按《中华人民共和国著作权法》等有关规定接受处理并承担法律责任。任何收存和保管本论文各种版本的其他单位和个人(包括研究生本人)未经本论文作者的导师同意，不得有对本论文进行复制、修改、发行、出租、改编等侵犯著作权的行为，否则，按违背《中华人民共和国著作权法》等有关规定处理并追究法律责任。(保密的学位论文在保密期限内，不得以任何方式发表、借阅、复印、缩印或扫描复制手段保存、汇编论文）研究生签名：艰时间：年匕月I曰 Classificationcode:S814.3Universitycode:10712UDC:636.4Postgraduatenumber:2013050564Confidentialitylevel:NonConfidentialThesisfortheFull-timeProfessionalMaster’sDegreeNorthwestA＆FUniversityin2015EFFECTSOFDIFFERERNTSPERMPLASMAMEMBRANEPROTECTANTONBOARSEMENSTOREDATNORMALTEMPERATUREType:AgriculturalExtensionResearchfield:BreedingNameofPostgraduate:QiLiuAdviser:Prof.Jian-HongHUDateofsubmission:May,2015YanglingShaanxiChina 本研究由国家生猪产业技术体系（CARS-36）杨凌示范区科技计划项目（2014NY-22）支持ThisresearchwassupportedbytheNationalSwineIndustryTechnologySystem(CARS-36)andtheScientificandTechnologicalProjectofYanglingDemonstrationZone(2014NY-22). 不同精子质膜保护剂对猪精液常温保存效果的影响摘要为了研究氨基酸类保护剂（牛磺酸、L-谷氨酰胺）和中药活性成分（五味子乙素、三七皂甙R1）对猪精液常温保存效果的影响，首先设计4种稀释液配方，检测其保存过程中精子活率、有效保存时间、质膜完整率、顶体完整率，筛选出保存效果最好的基础配方。然后在基础配方中添加分别添加0.5、1、5、10mmol/L的牛磺酸（Tau），0.5、1、2、4、8、16mmo/L的L-谷氨酰胺（Gln），1、5、10、15μmol/L的五味子乙素（SchB）和0.5、1、2、4、8、16mmo/L的L-谷氨酰胺（Gln），设置空白对照组，检测精液品质及总抗氧化能力（T-AOC）和丙二醛（MDA）浓度，分析对猪精液保存效果的影响，确定最适添加量，旨在开发新型猪精液常温保存的稀释粉。本研究主要获得如下结果：1.在4种自配猪精液常温保存稀释液中，“稀释液3”，主要成分是葡萄糖40g/L，柠檬酸钠6.8g/L，碳酸氢钠0.8g/L，EDTA1.5g/L，柠檬酸0.3g/L，氯化钾0.7g/L，有效保存时间显著高于其他3种稀释液（P<0.05），有效保存时间为4.4d，保存第4d的精子活率为0.61，质膜完整率是57.32%，顶体完整率是78.12%；其次是“稀释液2”和“稀释液4”，保存效果最差的是“稀释液1”。因此，“稀释液3”是4种自配猪精液常温保存稀释液中保存效果最好的稀释液配方，可作为基础稀释液。2.在基础稀释液“稀释液3”中分别添加不同浓度的牛磺酸（Tau）和L-谷氨酰胺（Gln），表明添加5mmol/L的Tau时，精子活率、顶体完整率、总抗氧化能力（T-AOC）浓度显著高于其他组（P<0.05），丙二醛（MDA）浓度显著低于其他组（P<0.05），保存第5d时，精子活率为0.66、顶体完整率47.48%、质膜完整率为72.10%、T-AOC浓度4.28IU/mL、MDA浓度1.63nmol/mL。添加4mmol/L的Gln，精子活率、质膜完整率和顶体完整率显著高于其他组（P<0.05），保存第5d时，精子活率为0.59、质膜完整率47.05%、顶体完整率为74.40%、T-AOC浓度4.34IU/mL、MDA浓度1.51nmol/mL；添加16mmol/L的Gln，精子活率、质膜完整率和顶体完整率显著低于其他组（P<0.05）。表明添加5mmol/L的Tau或4mmol/L的Gln对维持精子活率，保护精子质膜，增强精子抗氧化能力效果显著。3.在“稀释液3”中分别添加不同浓度的五味子乙素（SchB）和三七皂甙R1（NotoginsenosideR1），表明添加15μmol/L的SchB精子活率、质膜完整率、T-AOC浓度显著高于其他组（P<0.05），MDA浓度显著低于其他组（P<0.05），保存第5d时，精子活率、质膜完整率、T-AOC浓度、MDA浓度分别为0.61、50.71%、4.82IU/mL、1.45nmol/mL；添加1、5、10、15μmol/L的SchB，对精子顶体完整率有明显的保护作用，但组间差异不显著（P>0.05）。添加5mmol/L的三七皂甙R1精子质膜完整率、顶体完整率、T-AOC的浓度显著高于其他组（P<0.05），保存第5d时，精子质膜完整率 为57.10%、顶体完整率为73.70%、T-AOC的浓度为4.65IU/mL；添加1.25、2.5、5、10mmol/L的三七皂甙R1对降低MDA浓度作用不显著（P>0.05）；保存第1~3d，添加1.25、2.5、5、10mmol/L的三七皂甙R1对降低MDA浓度作用明显，组间有差异性，但差异不显著（P>0.05）。因此，SchB可显著提高精液保存品质，提高猪精液常温保存时抗氧化能力，其最适添加量为15μmol/L。三七皂甙R1可维持精子形态完整，提高猪精液常温保存时抗氧化能力，其最适添加量为5mmol/L。关键词：猪精液；稀释液；精子质膜保护剂；精子活率；抗氧化性能 EFFECTSOFDIFFERERNTSPERMPLASMAMEMBRANEPROTECTANTONBOARSEMENSTOREDATNORMALTEMPERATUREABSTRACTInordertoinvestigatetheeffectoftaurine,L-Glutamine,SchisandrinB,NotoginsenosideR1onboarsemenpreservationatnormaltemperature,fourdifferentfoundationformulawereusedandspermmotilitypreservationprocess,effectivelysurvivaltime,plasmamembraneintegrityandacrosomeintegrityweredetectedinthisstudy.Afterscreeningthebestfoundationformula,addeddifferentconcentrationsoftaurine(0,0.5,1,5and10mmol/L),L-Glutamine(0,0.5,1,2,4,8and16mmo/L),SchisandrinB(0,1,5,10and15mmol/L)orNotoginsenosideR1(0,1.25,2.5,5,10and20mmol/L),andtestsemenquality,totalantioxidantcapacity(T-AOC)andmalondialdehyde(MDA)concentration,studyitseffectonsemenqualityduringpreservation,determinetheoptimaladditiveamount,aimstodevelopnewtypeextenderofboarsemenpreservationatroomtemperature.Theresultsofthisstudyshowedthat:1.Amongthefourself-madeextender,itincludesofglucose40g/L,sodiumcitrate,6.8g/L,sodiumbicarbonate0.8g/L,EDTA1.5g/L,citricacid0.3g/Landpotassiumchloride0.7g/L.Theeffectivesurvivaltimeofextender3(4.4d)wassignificanthigherthanthatofotherextenders(P<0.05),andafterfourdayspreservation,thespermmotilityrate,plasmamembraneintegrityandacrosomeintegritywere0.61,55.32%and75.12%,respectively.Followedbyextender2,thepreservationeffectofextender1andextender4wasworserthanotherextenders.Therefore,theextender3isthebestextenderamountthefourself-madeextendersandcouldbeusedasthebasisinthenextstageexperiment.2.AfteraddeddifferentconcentrationstaurineorL-Glutamine,theresultindicated:whenadded5mmol/Ltaurine,thespermmotilityrate,acrosomeintegrityandtheconcentrationoftotalantioxidantcapacity(T-AOC)weresignificanthigherthanothergroups(P<0.05),MDAconcentrationwassignificantlowerthanothergroups(P<0.05).Afterfivedayspreservation,thespermmotilityrate,plasmamembraneintegrity,acrosomeintegrityandtheconcentrationoftotalantioxidantcapacity(T-AOC)andmalonaldehyde(MDA)were0.66,47.48%,72.10%,2.28IU/mLand2.63nmol/mLinthegroupadded5mmol/Ltaurine.Thespermmotilityrate,spermplasmamembraneintegrity,spermacrosomeintegrityinthegroup added4mmol/LL-Glutamineweresignificanthigherthanothergroups(P<0.05).Afterfivedayspreservation,thespermmotilityrate,spermplasmamembraneintegrity,spermacrosomeintegrityandtheconcentrationoftotalantioxidantcapacity(T-AOC)andmalonaldehyde(MDA)were0.59,47.15%,74.40%,2.34IU/mL,1.51nmol/mLinthegroupadded4mmol/Ltaurine.Thespermmotilityrate,spermplasmamembraneintegrity,acrosomeintegrityinthegroupadded16mmol/LL-Glutamineweresignificantlowerthanothergroups(P<0.05).Thus,added5mmol/Ltaurineor4mmol/LL-Glutamineinextenderofboarspermisthebestwaytoincreasetheresultofpreservationinnormaltemperaturepreservation.3.AfteraddeddifferentconcentrationsSchisandrinBorNotoginsenosideR1inextender3,theresultindicated:thespermmotilityrate,spermplasmamembraneintegrityandT-AOCinthegroupadded15μmol/LSchisandrinBinextender3weresignificanthigherthanothergroups(P<0.05),andMDAconcentrationwassignificantlowerthanothergroups(P<0.05);whiletherewerenosignificantdifferentinspermacrosomeintegrity(P>0.05)amongthegroupsadded1,5,10,15μmol/LSchisandrinB.Afterfivedayspreservation,thespermplasmamembraneintegrityandthespermacrosomeintegritywere57.10%,73.70%.Theconcentrationoftotalantioxidantcapacity(T-AOC)andmalonaldehyde(MDA)were2.65IU/mL,2.85nmol/mLinthegroupadded5mmol/LNotoginsenosideR1afterfourdayspreservation.Thespermplasmamembraneintegrityandspermacrosomeintegrityinthegroupadded5mmol/LNotoginsenosideR1weresignificanthigherthanothergroups(P<0.05),andtheMDAconcentrationingroupsadded1.25,2.5,5,10mmol/LNotoginsenosideR1weresignificantlowerthanothergroups(P<0.05).Thus,bothSchisandrinBandNotoginsenosideR1canincreasetheanti-oxidationabilityandthequalityofboarsemenduringnormaltemperaturepreservation,andtheoptimumadditionconcentrationare15μmol/Land10mmol/L,respectively.KEYWORDS:Boarsemen,Extender,Protectantofspermplasmamembrane,Spermmotility,Antioxidantcapacity 目录文献综述....................................................................................................................................1第一章猪精液常温保存稀释液配方的研究进展..................................................................1前言....................................................................................................................................11.1猪精液常温保存稀释液的研究现状..........................................................................11.1.1猪精液常温保存稀释液配方主要成分.............................................................21.1.2猪精液常温保存效果的影响因素.....................................................................41.2精子保护剂.................................................................................................................61.2.1牛磺酸................................................................................................................61.2.2L-谷氨酰胺.........................................................................................................71.2.3五味子乙素........................................................................................................71.2.4三七皂甙R1......................................................................................................81.3精子品质的检测指标..................................................................................................81.3.1精液品质常规指标检测....................................................................................81.3.2其他指标的检测及方法.....................................................................................91.4本研究的目的和意义..................................................................................................91.4.1研究目的.............................................................................................................91.4.2研究意义...........................................................................................................10试验研究..................................................................................................................................11第二章猪精液常温保存基础稀释剂研究............................................................................11前言..................................................................................................................................112.1材料与方法................................................................................................................112.1.1试验材料...........................................................................................................112.1.2试验方法...........................................................................................................122.1.3检测指标及方法...............................................................................................132.1.4统计分析...........................................................................................................132.2结果与分析...............................................................................................................132.2.1自配稀释液对猪精子活率的影响...................................................................132.2.2自配稀释液对猪精子质膜完整率的影响.......................................................142.2.3自配稀释液对猪精子顶体完整率的影响.......................................................152.3讨论............................................................................................................................152.3.1稀释液不同成分对猪精液常温保存效果的影响..........................................152.3.2自配稀释液对猪精子活率、顶体完整率、质膜完整率的影响..................16 2.4小结............................................................................................................................17第三章氨基酸类保护剂（牛磺酸和L-谷氨酰胺）对猪精液常温保存效果的影响.......18前言..................................................................................................................................183.1材料与方法................................................................................................................193.1.1试验材料...........................................................................................................193.1.2试验方法...........................................................................................................193.1.3检测方法...........................................................................................................193.1.4统计分析...........................................................................................................193.2结果与分析...............................................................................................................203.2.1Tau对猪精液常温保存精液品质的影响........................................................203.2.2Tau对猪精液中T-AOC和MDA浓度的影响...............................................213.2.3Gln对猪精液常温保存精液品质的影响........................................................223.2.4Gln对猪精液中T-AOC和MDA浓度的影响..............................................243.3讨论............................................................................................................................253.3.1Tau对猪精子活率、质膜完整率和顶体完整率的影响................................253.3.2Tau对猪精液T-AOC和MDA浓度的影响...................................................263.3.3Gln对猪精子活率、质膜完整率和顶体完整率的影响................................263.3.4Gln对猪精液T-AOC和MDA浓度的影响..................................................273.4小结............................................................................................................................28第四章中药保护剂（五味子乙素和三七皂甙R1）对猪精液常温保存效果的影响......29前言..................................................................................................................................294.1材料与方法................................................................................................................304.1.1试验材料...........................................................................................................304.1.2试验方法...........................................................................................................304.1.3检测方法...........................................................................................................304.1.4统计分析...........................................................................................................304.2结果与分析...............................................................................................................314.2.1五味子乙素对猪精液常温保存精液品质的影响..........................................314.2.2五味子乙素对猪精液中T-AOC和MDA浓度的影响................................324.2.3三七皂甙R1对猪精液常温保存精液品质的影响.......................................334.2.4三七皂甙R1对猪精液中T-AOC和MDA浓度的影响..............................354.3讨论............................................................................................................................364.3.1五味子乙素对猪精液常温保存效果的影响...................................................364.3.2三七皂甙R1对猪精液常温保存效果的影响................................................374.4小结............................................................................................................................37 结论......................................................................................................................................38进一步研究内容......................................................................................................................38参考文献..................................................................................................................................39致谢......................................................................................................................................45作者简介..................................................................................................................................46 第一章猪精液常温保存稀释液配方的研究进展1文献综述第一章猪精液常温保存稀释液配方的研究进展前言猪人工授精技术不仅降低了猪病的传播、提高母猪生产性能等，还扩大了良种利用率。猪人工授精技术是推动我国养猪业向规模化、专业化转变的关键繁殖技术，目前，我国养猪业利用猪人工授精技术的比例为85%（马乃祥2013）。在猪人工授精过程中，超过99%是使用常温保存（15~20℃）0~5d的稀释精液（霍立军2013），受胎率最好可高达80~90%（金从福等2010），与自然交配条件下的受胎率类似。总而言之，猪精液常温保存稀释液的研究对提高猪的生产性能有着至关重要的影响，而猪常温保存稀释液配方的研究是保证猪人工授精效果，提高母猪受胎率的重要前提。1.1猪精液常温保存稀释液的研究现状在常温保存过程中，猪精液常温保存稀释液主要是为精子活动提供所需的能量，创造相对稳定的生存环境，抑制微生物生长繁殖，从而达到保证猪精液品质的目的。通常常温保存稀释粉可分为短效稀释粉和中效稀释粉以及长效稀释粉三种，其对猪精液有效保存时间分别为0~3d、3~5d和5d以上。Milawov（1934）研究发现猪精液稀释液中添加血清白蛋白，可显著提高精子活率和受精能力。1975年，PurselandJohnson（1975）研发了BTS进行猪精液冷冻保存效果，效果良好，其配方内主要含有氯化钾，用于补充精子膜内K+流失，维持膜上Na+-K+-ATP酶活性，增强猪精液冷冻保存效果。随后，BTS用于猪精液常温保存，其是世界上运用最广泛的猪精液常温短效稀释液。Gottardi等（1980）研发出第一个猪精液常温保存稀释剂，其主要成分包括葡萄糖、柠檬酸钠、碳酸氢钠、EDTA、Tris、柠檬酸、牛血清白蛋白（BSA）、半胱氨酸，命名为Zorlesco。但由于Zorlesco中各物质组成不平衡，渗透压低于精子耐受值（240mOsm），其保存效果不理想。之后，Moretti（1981）在Zorlesco的基础上，去除BSA和半胱氨酸，并改变其他稀释液成分的浓度，研发出新型稀释液，命名为Modena（LaforestandAllard1996;Johnsonetal.1988），目前仍在全世界范围内广泛应用。Summermatter（1984）通过反复试验，在Modena的基础上添加了BSA和胱氨酸，并且增加了葡萄糖在稀释液中的比例，命名为Butchwiler。1984年，MartínRillo研发的稀释液MR-A在世界范围内广泛使用，其稀释液配方却没有公布，是目前商品稀释液中效果较好的长效稀释液之一。Weitze（1990）发现并使用HEPES作为稀释液中的缓冲剂，同时，还添加了BSA作为蛋白保护剂，替代精浆蛋白对精子质膜进行保护。但近几十年，研究出的新型猪常温保存稀释液较少，且未公布其配方，无法深入研究其保存效果（刘玉2013）。目前，在 2不同精子质膜保护剂对猪精液常温保存效果的影响我国销售使用的稀释粉品牌繁杂，主要以国外品牌为主，例如丹麦的亚卫、比利时的CMX、日本的全能键Z等，其大部分在国内属于代售，使得稀释粉价格偏高，提高了生产成本，影响我国养猪业可持续发展。我国稀释粉品牌较少，知名度较低，质量较之国外品牌稀释粉有一定差距。1.1.1猪精液常温保存稀释液配方主要成分在常温保存过程中，猪精液常温保存稀释液主要是为精子体外生存活动提供一个能够调节精子内环境稳态的液态环境，为精子新陈代谢和活动提供能量。同时，常温稀释剂还是保证精液在不恒定的室温条件下，保证精子活率，可逆地抑制精子新陈代谢活动，保持其受精能力（鲜红和郑鸿培2004）。目前，关于猪精液常温保存稀释液的研究主要在两大领域，一是筛选新型稀释液配方（陈玉霞等2012），二是在稀释液中添加不同的保护剂、抗氧化剂、抗凋亡物质等，研究其对猪精液常温保存时精液品质的影响。1.1.1.1营养物质在猪精液常温保存过程中，精液稀释剂不仅用于增加精液容积，还为精子维持正常代谢活动提供能量及营养物质（Gadea2003；张宝勋等2009）。葡萄糖可以为精子运动提供能量，还是维持稀释液渗透压的重要成分，保证精子体外恒温保存过程中处于一种稳定状态。夏天等（2005）研究发现，当葡萄糖含量约为稀释液的5%左右时，其保存时间不宜过长，因为高糖分环境影响稀释液渗透压，促进微生物生长增殖等，导致精液保存质量下降。周歧生和陆增康（1986）研究发现，蜜糖可代替葡萄糖，且效果理想，研究表明可能是蜜糖中不仅含有葡萄糖而且还有果糖、蔗糖等其他营养成分，并且具有一定的抗菌效果，所以更有利于精液保存。蔗糖作为二糖，对维持质膜内外渗透压，提高精子质膜完整率同样起重要作用（SalamonandMaxwell2000）。侯丽鹏等（2012）研究表明，在稀释剂中加入海藻糖可以增加精子质膜流动性，与磷脂形成氢键，稳定质膜，可显著提高猪精液常温保存的精液品质，最适添加量为150mg/mL。乳糖作为还原性二糖，不仅可以为精子新陈代谢提供能量，稳定质膜内外渗透压，还能增强精子质膜的抗氧化能力，保护质膜，提高稀释液稳定性（潘红梅等2015）。1.1.1.2缓冲物质新鲜猪精液的pH在7.2~7.4左右，当pH降低时，精子的新陈代谢和运动性都随之下降，因此，为使得猪精液在常温条件下长时间保存，稀释液最适宜pH范围在6.5~6.9（林峰等2012）。但应当注意刚配制好的稀释液pH在60～90min内不稳定，并且不同稀释液的pH随时间变化规律不同（Newth1999）。因此，在提前配制稀释液时需要完全溶解后静置平衡使稀释液均一稳定，以免在保存时对精子造成不必要的损伤。在稀释剂中添加缓冲物质可以防止稀释精液pH的大幅度波动。最常用的缓冲剂是碳酸氢盐和柠檬酸钠，但其缓冲能力有限。此外还有一些缓冲剂，如TES、HEPES、MOPS和Tris，这些缓冲剂的缓冲能力更强缓冲范围更广，而且HEPES和MOPS的缓冲效果不 第一章猪精液常温保存稀释液配方的研究进展3受温度的影响（耿果霞等2013）。1.1.1.3无机盐离子精子在常温保存过程中需要一定浓度的离子维持精子正常形态，维持精子生存和活动。通常精子膜外Na+浓度高于膜内浓度，K+主要存在精子膜内，其二者浓度差保持平衡，精子通过膜上的Na+-K+-ATP酶为精子运动提供能量。因此，在稀释剂中添加一定的K+可防止精子内耗竭K+而丧失运动能力。高飞等（2004）研究表明，稀释剂中添加乙二胺四乙酸二钠（EDTA）可以螯合稀释精液中的Ca2+，避免在常温保存过程中由于Ca2+内流引起精子获能，不利于精液的长期保存。1.1.1.4抗生素一般情况下，公猪雄性生殖道内无菌，精液污染主要由于采精过程中卫生条件不达标、操作不规范、精液保存环境不卫生等使精液被微生物污染（Martínetal.1998）。稀释液中含有一定浓度的葡萄糖在精液常温保存时会促进大肠杆菌、沙门氏菌和一些假单胞菌属的生长。细菌污染会对精液产生许多不利影响，包括活力下降、精子凝集、顶体破损以及pH降至酸性（5.7～6.4）等（Althouseetal.2000），降低精液品质，影响精子受精能力。因此添加适当浓度的抗生素可以改善精液保存效果（Colenbranderetal.2003）。青链霉素是使用最早、最广泛的抗生素组合。有研究报道，庆大霉素、新霉素、卡那霉素也被成功应用于精液稀释液中，添加浓度约为200mg/L（张金龙等2005)。在猪17℃保存精液中添加聚维酮碘（PVP-Ⅰ)，其可杀灭精液有害细菌，阻断病原菌垂直传播，增强精液品质（包宋权等2011）。1.1.1.5抗氧化剂在精液的保存过程中，精子质量下降与呼吸代谢过程中产生的活性氧族（ROS）有关（Bilodeauetal.2002）。低浓度的ROS可提高精子活力，增强精子受精能力，但高浓度的ROS会造成精子脂质过氧化（LOP），破坏精子质膜结构，降低精子活力，影响精子受精能力（Wai-Sumetal.2006）。谷胱甘肽（GSH）是一种三肽化合物，可抑制精子质膜上的LOP的发生。张文举（1997）等研究认为，牛精液中加入GSH可明显提高解冻后精子受胎率。Gadea等（2004，2005）研究表明，随着猪精子质膜结构发生变化，精子内GSH含量大幅度减少，在猪冷冻稀释精液中添加1mM的GSH对提高精子活力效果最佳。在猪冷冻稀释液中联合添加100IU/mLSOD和200IU/mLCAT明显提高冷冻-解冻后精子活力、活率、质膜完整率和顶体完整率（任俊玲等2012）。褪黑素对精子冷冻具有保护效应，分别单独添加0.25mg/mL褪黑素、5mmol/L谷胱甘肽，或联合添加0.125mg/mL褪黑素和1mmol/L谷胱甘肽,均能减少精液冷冻过程中ROS的生成，显著提高冷冻精子解冻后的质量，其中联合添加效果显著优于单独添加效果（李博玲等2011）。在猪精液冷冻稀释液中联合添加生物类黄酮和维生素C，解冻后精液质量显著高于对照组（李芳等2012）。添加甲基黄嘌呤、丁羟甲苯、维生素E及褪黑素等抗氧化剂可以有效改善冷冻保存猪精液的精子运动学参数，保护精子质膜、顶体和 4不同精子质膜保护剂对猪精液常温保存效果的影响DNA完整性，提高冷冻-解冻后精子的受精能力（杜立银等2008）。1.1.1.6其他保护成分海藻糖作为一种非渗透性保护剂，能在细胞膜外形成一层保护膜，从而保护细胞膜的完整性，同时海藻糖还具有稳定细胞膜蛋白质的作用（Alex2005）。精子质膜对于维持自身的新陈代谢、精子获能、顶体反应等都至关重要。因此，海藻糖在精液的冷冻保存中被大量使用并取得良好的保存效果。牛血清白蛋白（Bovineserumalbumin，BSA）是一种蛋白类保护剂，能通过多种途径保护精子，补充精液稀释时降低的与维持、激活精子运动有关的蛋白，保证精子运动能力；选择性结合精子质膜上的磷脂，稳定精子结构；防止精子冷冻时Ca+内流入精子胞质，提前获能；中和精子和细菌代谢副产物；起一定缓冲作用和抗氧化作用；减少稀释造成的精子头部带相反电性电荷所引起的头对头凝集（刘玉等2013）。张宝勋等（2009）筛选出最佳精液稀释剂配方中含有氨基乙酸，并且指出氨基乙酸作为弱电解质可以降低稀释液中电解质浓度，防止精子膜受损，氨基乙酸同时具有为猪精液常温保存提供能量的作用，能提高精子的活力和受精能力。稀释液还有一些其他保护成分，可以增强精液保存效果，如抗凋亡药物盐酸川穹嗪在猪精液常温（16~18℃）保存时，显著延长精子的有效存活时间、总存活时间并提高存活指数（胡传水等2013）；添加一定浓度的葛根素或酒石酸美托洛尔可以显著提高猪精液常温保存的精液品质（胡传水等2014）。1.1.2猪精液常温保存效果的影响因素影响猪精液常温保存的主要因素包括温度、酸碱度、渗透压、稀释比例、抗生素种类等，控制精液保存过程中的这些影响因素是延长精液保存时间，提高常温保存的精液品质的关键性步骤。1.1.2.1温度由于猪精子的特殊性，如果将新鲜精液迅速冷却到15℃以下，会对低温产生一定的抗性，精子活率会显著降低，这种现象称为“冷休克”（Purseletal.1973）。猪精子对温度敏感性较高，温度变化引起精子质膜脂质双分子层的侧向流动性下降，而精子质膜磷脂上温度耐受性随质膜结构的不同而不同，不等温的磷脂层由于运动方式的不同而出现分离，造成质膜破损，精子结构被破坏，内容物流失，膜上和胞内酶活性受到抑制或者失活，甚至导致精子细胞核内DNA的结构发生改变（Johnsonetal.2000）。通常猪精液常温保存温度为15~20℃，17℃条件下保存的稀释精液，其活力、有效保存活时间、生存指数显著高于其他温度，保存效果最好（潘越博等2013）。1.1.2.2酸碱度新鲜猪精液的pH呈弱碱性，当稀释液中酸根离子增多时，精子的糖代谢和运动性都随着下降，因此，为使得猪精液在常温条件下长时间保存，稀释液的pH都略低于鲜精的pH，林峰等（2012）研究表明，稀释液最适宜pH范围在6.5~6.9，即弱酸性环境 第一章猪精液常温保存稀释液配方的研究进展5有助于精液长期保存。但也有学者认为精液在保存过程中会产生酸性代谢产物，而碱性稀释液能中和一部分酸性物质，防止稀释液过酸造成精子死亡（戈新等2011）。虽然对于猪精液常温保存最适pH研究无统一定论，但稀释液中添加一定量的缓冲剂可以维持精液pH的动态平衡，是具有保护精子的作用。1.1.2.3稀释液渗透压猪原精的渗透压是290～300mOsm，超过这一范围或是低于这一范围，猪精子常温保存效果都会受到影响。在低渗环境下，精子膜通透性发生改变，易破坏精子质膜完整性（Fraseretal..2001;Gilmoreetal.1996）。鲜红等（2004）研究报道，当稀释液冰点下降值与精液相似或略高于原精渗透压时，保存效果较理想，即等渗条件或略高渗时有助于精液保存。1.1.2.4抗生素种类MartínRillo等（1998）研究表明，原精中存在致病菌，养猪企业进行的精液定期检测微生物种类，对保证精液品质至关重要。通过添加适当浓度的抗生素可以改善精液保存效果，提高受精能力（Colenbranderetal.1993）。添加不同种抗生素，其对精液保存效果也不尽相同，通过在稀释液中添加不同浓度的恩诺沙星和庆大霉素对猪精液进行常温保存试验，潘红梅等（2007）研究表明，含400IU/mL恩诺沙星和480IU/mL庆大霉素的精液常温保存效果较好。通过比较恩诺沙星、氧氟沙星、菌特灵与青、链霉素对精液保存效果的影响，发现添加恩诺沙星的保存效果优于其它抗生素（茆达干等2002）；阿奇霉素、林肯霉素的抗菌效果次之，青链霉素的抗菌效果再次之，新霉素、卡那霉素的抗菌效果最差（张金龙等2005）。1.1.2.5抗氧化水平猪精液中含有大量的不饱和脂肪酸（PUFA），精清及精子中具有抗氧化能力的酶类如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）、谷胱甘肽还原酶（GR）、过氧化氢酶（CAT）以及生育酚、谷胱甘肽等非酶类物质（Baumber2005），用以消除精子呼吸作用产生的活性氧（ROS），使ROS的产生-消除处于平衡状态。随着精液保存时间的延长，精液内环境发生变化，抑制了精子内抗氧化酶对ROS的消除作用，过多的ROS作用于精子膜上的PUFA，使精子质膜发生脂质过氧化（LOP）（Chatterjeeetal.2001），破坏了精子结构，从而降低精子质量。Watson（2000）研究表明，LOP是降低精子活率的重要原因之一。GSH是一种广泛存在于哺乳动物细胞内的含有巯基（-SH）的三肽，具有抗氧化作用。作为SOD、CAT、GSH-PX、GR等抗氧化酶的辅助因子，外源性补充GSH能够抑制LOP，降低ROS对细胞的毒害作用（Anisarietal.2010）。对精液进行冷冻处理时，SOD活力降低，分子量增加，但增量与SOD活性无统计学差异。抗氧化剂L-半胱氨酸单独添加或是与富含DHA的卵黄联合使用，都显著提高猪冷冻精液解冻后的活力、顶体完整率，增强猪冷冻精液质量。抗坏血酸可降低精液在冷冻过程中的脂质过氧化水平，提高解冻后精子的活力，同时其添加量与作用效果呈正相关。 6不同精子质膜保护剂对猪精液常温保存效果的影响但加入丙酮酸不能改善精子品质，也不能减少精子脂质过氧化水平。虽然加入抗坏血酸或丙酮酸未显示与α-生育酚协同效应，当稀释剂中加入抗氧化剂，明显降低由于脂质过氧化对精子质膜的损伤，提高精子活力（吴晶晶等2014）。在猪的冷冻精液中加入半胱氨酸（CYS），可以增强冻精人工授精效率，增强冻精人工授精效果（魏世宝等2007）。1.2精子保护剂猪精液在常温条件下保存，精子的新陈代谢会产生酸性物质，导致精液pH降低，使精子活率下降（戈新等2011）。猪精子在常温保存过程中，精子头部携带相反电荷，会出现精子凝集、粘连的现象，不仅使精子质膜遭到损伤，死亡精子还使得稀释精液中活性氧（ROS）产生量增加，造成精子氧化损伤加剧，精液品质降低。为延长精液常温保存时间，提高保存效果，在精液稀释液中添加精子质膜保护剂，可以使猪精子质膜完整率、抗菌性、抗氧化性等提高。1.2.1牛磺酸牛磺酸（taurine，Tau），化学名称为β-氨基乙磺酸，是一种含硫氨基酸，在动物体内以游离形式存在，其最早在黄牛胆汁中分离而得，又被称为牛胆碱或牛胆素（谭乐义等2000）。牛磺酸不参与任何蛋白质合成代谢途径，但在动物体内其合成与半胱亚磺酸脱羧酶（CSAD）活性有关，该酶是牛磺酸合成过程中的限速酶，主要原料是半胱氨酸，其在哺乳动物体内活性较低，影响牛磺酸的形成，通常需要外源性补充牛磺酸来维持动物体正常需求（陈玉珍1994）。其纯品为白色或无色晶体，化学性质稳定，广泛存在与生物体中枢神经系统、平滑肌、视网膜、心脏、肝脏等组织器官中。1886年，Schmeideberg等人最先发现牛磺酸有药物作用。1975年，Hayes等人研究表明幼猫因摄入缺乏牛磺酸的饲料而失明，证明牛磺酸具有营养作用，引起人们极大关注。经研究表明，牛磺酸具有多种生理功能，如：具有抗氧化作用；保护视网膜免受损伤，提高动物视力，降低白内障发生率；乳化脂肪，影响脂肪代谢的（温宝书，张敏1995）；中和细菌产生的毒素，降低胆酸毒性，保护肝细胞膜；降低胆固醇含量，抑制胆结石的形成，抗肿瘤的活性（林钧明1991）；与哺乳动物脑部发育有关，当补充外源性牛磺酸时，动物体脑部正常发育且学习能力会增强（陈蕾1994）；调节动物体血糖含量，协同胰岛素，降低动物体血糖含量；牛磺酸与动物体生殖能力也有关系。在雌性生殖生理中领域，有研究表明，当饲料中缺乏牛磺酸时，会导致怀孕母畜流产、死胎、生殖能力降低，还会引起幼仔生长发育异常。同时。牛磺酸还可促进胚胎发育。叶荣等（2004）研究报道，在细胞培养液中加2.5mmol/L的牛磺酸可以提高小鼠细胞卵裂率。由于牛磺酸具有抗氧化性、渗透性、营养性，可促进猪、牛、羊的胚胎体外发育对于雄性动物而言，牛磺酸存在于睾丸间质细胞、睾丸平滑肌及周围血管内皮细胞等部位，牛磺酸是精液中含量最多的游离氨基酸之一，它具有清除自由基的能力，降低 第一章猪精液常温保存稀释液配方的研究进展7精子膜的脂质过氧化损伤，还可通过抑制精子膜上磷脂甲基转移酶活性，改变精子膜上Na+-K+-ATP酶活性（谭乐义等2000）。牛磺酸可提高牛、羊、鹿等冷冻-解冻后精子活率，增强体外获能能力（黄建明等1999；赵本田等2009；马杨君2007）。Foote等（1993）研究表明，添加24mmol/L的牛磺酸对牛的冷冻精液中精子膜具有保护作用，可提高精子质膜和顶体膜的完整性，可能与牛磺酸的抗氧化性与渗透压调节能力有关。但牛磺酸在猪精液常温保存过程中的应用报道较少。1.2.2L-谷氨酰胺谷氨酰胺是机体内重要的必需氨基酸，可以为蛋白质、核酸代谢提供氮源，还可发生氧化反应提供能量（Vanetal.1998）。金其贯和杨则宜（2003）研究表明，L-谷氨酰胺具有维持肠道稳定，增强免疫力、抗氧化等生物学作用。目前，L-谷氨酰胺广泛应用于医药、保健、食品等领域。L-谷氨酰胺作为一种重要的“条件限制性氨基酸”，具有稳定精子质膜结构，预防精子冷打击造成质膜破损的功能被广泛用于冷冻精液（Mercadoetal.2009）。L-谷氨酰胺是合成谷胱甘肽的重要原料，可以增强通过精液内谷胱甘肽还原酶的活性（张伟等2011）。GSH抗氧化原理为：第一，GSH可以催化GSH-PX活性，清除细胞内的H2O2，切断LOP循环链；第二，GSH可直接清除自由基，从H2O2和氧自由基夺取电子，使其还原成H2O；第三，GSH可保护细胞膜PUFA形成稳定的化合物，使之免受ROS攻击（段洪云等2013）。给小鼠体内补充504.9~687.3μmol/L的谷胱甘肽，可显著提高血液中谷胱甘肽还原酶和谷胱甘肽氧化酶的含量（于建春等1996）。对过度运动者补充外源性谷氨酰胺，可以为血液内GSH合成提供所需原料，提高GSH的抗氧化能力，降低体内MDA含量，但对SOD无促进作用（乔玉成2002）。谷氨酰胺作为能源物质以及抗氧化物质，可以提高机体缺氧耐受力，增强运动性，减少运动产生的酸性物质（石薇等2011）。1.2.3五味子乙素目前，国内外对猪精液常温保存稀释液的研究主要集中在添加蛋白保护剂、抗生素、抗氧化剂等化学物质方面，局限了研究范围，使得对猪精液常温保存稀释剂的研究进展缓慢。因此，开发新型稀释剂或添加剂是猪精液常温保存领域亟待解决的问题。中药不仅是我国重要的物质资源，还是古代人民智慧的结晶，其天然、无污染、生物性能丰富等特点，可以作为提高猪精液常温保存效果的添加剂。目前，中药对精液保存方面的研究主要是关于提高冷冻精液保存效果的报道，猪精液常温保存研究较少。五味子乙素（SchisandrinB，SchB）属于五味子属中的一种活性物质，属于木脂素类，是从五味子中分离的活性较强的一种（黄诒森1990）。刘丽等（2011）研究表明，SchB具有保肝、护眼、抗肿瘤、抗氧化等药理性作用。SchB对硫酸亚铁/半胱氨酸系统以及氯仿引起的氧化损伤有较好的保护效果，降低谷丙转氨酶释放量，维持肝细胞膜的完整性和稳定性（张铁梅等1989）。王蕾等（2006）研究表明，SchB可以降低过氧 8不同精子质膜保护剂对猪精液常温保存效果的影响化氢对眼睛晶状体和视神经的伤害，保护细胞DNA完整性。闫俊书等（2008）研究表明，饲料中添加五味子中活性物物质，可显著提高仔鸡血液和肝脏中谷胱甘肽还原酶活性。SchB对机体内自由基清理能力较强，尤其是消除含羟基自由基的能力比同浓度的维生素E和维生素C强（商红军等2012），SchB可与过氧化氢直接结合，起到机体抗氧化、抑制肝损伤的作用（闫荟羽等2014）。同时，还可增强抗氧化酶系统活性，尤其是谷胱甘肽氧化酶和还原酶、磷酸脱氢酶的活性，其作用效果与SchB的添加剂量呈正相关（Ipetal.1995）。SchB对金属离子诱发的细胞氧化损伤，也起保护作用（刘巍等2011）。SchB还可通过调节线粒体膜通透性，抑制Ca2+对细胞膜离子通道的敏感性（Puetal.2012）。SchB通过增加谷胱甘肽还原酶的活性的作用以及抑制金属蛋白酶活性的特性，修复阳光辐射造成的皮肤组织损伤，抑制成纤维细胞的表达，起到防衰老的作用（闫荟羽等2014）。SchB对抑制金黄色葡萄球菌和白色念珠杆菌抑制生长繁殖效果显著（李丽波等2013）主要作用机理不明确，可能是通过破坏细胞壁、细菌质膜以及细胞器结构，破坏细菌遗传物质完整性，抑制其生存繁殖；二是可能会通过作用于细菌中呼吸酶系统，抑制细菌有丝分裂（操庆国等2006）。SchB安全性高，在细胞培养过程中，添加1~25μmol/L的的SchB，对于细胞毒性作用较小，不会产生细胞毒株。1.2.4三七皂甙R1三七属于伞形目植物，主要用于止血、化瘀、防止肾肺纤维化、降压、降血脂、抗炎等的作用。三七的有效活性成分为三七总皂甙，包括：人参皂甙、三七皂甙R1等，三七皂甙R1是从三七总皂甙中分离出的，主要成分除了三七皂甙外还有多糖、蛋白、醇类、酮类以及脂类等成分组成（甘烦远和郑光植1992）。目前大量研究主要集中在三七皂甙的药理学活性方面，三七皂甙主要药理作用包括：调节细胞膜上Ca2+通道，引起Ca2+内流，使得血管收缩，升高血压的作用；提高机体缺氧耐受力，降低耗氧量（关永源等1990）；三七皂甙可以清除血液中脂肪，防止组织、血管纤维化形成，抑制血小板表面活性，防止血液凝聚，血栓的形成（张国强等1998）；通过改变细胞膜的通透性，增强微循环，有助于解决细胞毒性水肿（赵鹏等2004）；具有抗炎作用；能够直接清除机体内脂质过氧化物（LPO），降低组织细胞脂质过氧化损伤，同时还可通过提高机体内抗氧化酶，如：SOD、GSH-Px活性，抑制脂质过氧化产物MDA的形成（韦维等2014）。由于三七对因缺血引起的细胞及血管膜的通透性增加，脑细胞内水钠潴留引起的细胞毒性水肿等病变有保护作用（王根发等2002）。1.3精子品质的检测指标1.3.1精液品质常规指标检测精子质量的好坏决定着人工授精的成败，因此，对精液品质进行检测非常必要。常 第一章猪精液常温保存稀释液配方的研究进展9规的测定指标有精子活率、质膜完整率、顶体完整率、有效保存时间等。除此之外，还有一些抗氧化能力，酶活性的检测。精子活率是评价精子质量的一个重要指标，是保证输精后精子能够顺利通过雌性生殖道与卵子结合的前提。根据（GB/T25172-2010）精子活率是指37℃下呈直线运动的精子数占总精子数的百分率。精子质膜参与精子信号传导、精子获能、顶体反应等多种生物学反应，精子质膜的完整性可间接证明精子的死活。实验室检测质膜完整率的方法常用低渗肿胀试验（HOST），用果糖-柠檬酸钠低渗溶液稀释精液，利用精子在低渗溶液内吸水的特性，观察精子尾部弯曲率，若质膜完整，精子质膜的选择通透性会使外界稀释液的水进入精子内，造成尾部弯曲。检测标准是，精液中精子弯尾数越高，精液中精子质膜越完整，质膜完整率越高。实验室常用来测定精子顶体完整率的染料有伊红、台酚蓝、姬穆萨等非荧光性染料。其中姬穆萨染色操作简单，准确性较高，是目前生产中检测顶体完整率的主要方法。通过荧光探针技术测定精子质膜完整率提高了测定的准确性，荧光探针分为死精子特异性荧光探针和活精子特异性荧光探针，主要的染料有碘化丙啶（PI）、溴化乙啶（EB）、溴乙非啶二聚体（EH）等。与传统有机染料染色法相比，其灵敏度高，显色快，准确性强等特点，但其染料价格较高，制约了其在生产实践中的推广与应用。1.3.2其他指标的检测及方法1.3.2.1精子有效存活时间精子活率不低于0.6的保存时间。1.3.2.2氧化损伤程度指标丙二醛（MDA）是LOP的终产物之一，其含量与LOP水平成正相关（任俊玲等2012），其浓度可间接反映精液抗氧化水平。当单独加入400IU/mLCAT或与SOD混合加入，增强了解冻后猪精液的胚胎发育率，大大降低了ROS的产生量，但通过检测精液中丙二醛（MDA）的含量来判断脂质过氧化损伤程度，发现SOD和CAT的含量对MDA的产生无显著影响（Rocaetal.2005）。总抗氧化能力（T-AOC）通过检测精液中抗氧化物质（SOD、CAT、GST、VE、VC等）对Fe3+的还原产物的吸光度值，判断其抗氧化能力的高低，可直接反映精液的抗氧化水平。1.4本研究的目的和意义1.4.1研究目的（1）为增强稀释液的保存期限和常温保存效果，参考国内外猪精液常温保存稀释液配方，并通过检测精子活率、质膜完整率、顶体完整率、精子有效保存时间，筛选出保存效果最佳的稀释液配方。（2）为研究牛磺酸和L-谷氨酰胺对于维持精子质膜稳定性、保护精子质膜结构完 10不同精子质膜保护剂对猪精液常温保存效果的影响整性、精子抗氧化性的影响，通过添加不同浓度的牛磺酸、L-谷氨酰胺，检测其对猪精液常温保存过程中精子活率、质膜完整性、顶体完整性以及总抗氧化能力、MDA浓度的影响，探索出最适添加量，优化基础配方。（3）中药具有低毒高效的特点，其抗氧化性越来越受到关注，为研究其对猪精液常温保存效果的影响，在筛选出的自配猪精液常温保存稀释液中添加不同浓度的五味子乙素和三七皂甙R1，研究其对猪精液常温保存效果的影响，为开发新型保护剂提供理论数据支持。1.4.2研究意义（1）测定不同的自配猪精液常温保存稀释液稀释后的精子活率、质膜完整率、顶体完整率、有效保存时间，筛选出保存效果最好的稀释液配方，为在实际生产中推广提供数据支持，为之后优化配方提供理论依据。（2）比较在自配猪精液常温保存稀释液中添加不同浓度的牛磺酸和L-谷氨酰胺的保存效果，研究其对常温保存的猪精液品质、质膜完整性、抗氧化能力等的影响，确定猪精液常温保存过程中牛磺酸与L-谷氨酰胺的最适添加量，为优化配方，在猪精液常温保存稀释液中添加氨基酸类保护剂提供数据支持。（3）在自配猪精液常温保存稀释液中添加不同浓度的五味子乙素和三七皂甙R1，研究其对猪精液常温保存过程中精子活率、质膜完整率、顶体完整率、T-AOC、MDA含量的影响，为中药抗氧化剂在猪精液常温保存过程中的应用奠定理论基础。 第二章猪精液常温保存基础稀释剂研究11试验研究第二章猪精液常温保存基础稀释剂研究前言自20世纪50年代猪人工授精技术在我国试验成功，猪人工授精技术在我国逐渐发展和推广。目前，我国大型规模化养猪场几乎都是使用猪人工授精技术（薛振华等2009）。与猪自然交配繁殖相比，猪人工授精技术可以明显增加公猪精液利用率、提高母猪受胎率，降低公、母猪之间疾病传播，方便饲养管理，最主要的是提高养殖效益。猪精液品质是保证猪人工授精效果的重要因素（高飞等2004）。根据猪精液保存温度的差异性，可分为三种常温保存（17~25℃）、低温保存（0～5℃）以及冷冻保存（-79～-196℃）。相比与牛、羊、马等动物相比，猪精液对低温较为敏感（Feitsma2009），猪低温及冷冻条件下保存的精液的活率、人工授精的受胎率偏低，效果不理想，因此，猪精液的常温保存是目前生产实践最常用的保存方法。猪常温保存过程中，猪精液常温保存稀释剂是保证猪精液保存效果的重要因素。猪生产中使用的常温稀释剂跟据其有效保存时间，可分为短效（3d）、中效（3~5d）、长效（5d以上）稀释剂三类（侯丽鹏2012）。由于生产实际需要，猪稀释精液通常是“现配现用”，因而短效和中效稀释剂是目前市场上主要销售的。但是，目前我国主要使用的猪常温稀释液大多是国外品牌，成本较高，国产稀释液商品较少，稀释液稀释保存效果不理想，母猪受胎率无法保证，生产效益受损（江忠良等2011）。因此，自主研究猪精液常温保存稀释液对养猪业可持续发展，提高行业利益十分重要。本试验通过参考国内外资料，设计4种稀释液配方，通过检测稀释后的精液在17℃保存条件下的精子活率、有效保存时间、顶体完整率、质膜完整率，筛选出保存效果最好的配方，为自配稀释液的推广提供理论支持，为后续稀释液配方优化奠定基础。2.1材料与方法2.1.1试验材料2.1.1.1试验试剂葡萄糖、乙二胺四乙酸二纳（EDTA）、柠檬酸、柠檬酸钠、碳酸氢钠、氯化钾、果糖、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、庆大霉素（兽用）。2.1.1.2试验仪器高压真气灭菌锅（上海申安医疗器械厂），17℃恒温箱（北京田园奥瑞公司），水浴锅（江苏常熟医疗机械厂），电子分析天平（沈阳），荧光显微镜（日本Nikon），显微镜恒温加热板。 12不同精子质膜保护剂对猪精液常温保存效果的影响2.1.1.3精液来源试验精液来自陕西西安市杨凌区“李亚刚猪服务站”，共采集长白、大白、杜洛克三种种公猪精液各7头。利用徒手采精法收集精液，在采精过程中，收集公猪射精中段精子丰富部分，用4层纱布过滤精液去除精清。将采好的精液用3层毛巾包裹装于保温桶内，30min以内带回实验室进行稀释。稀释之前，观察精液品质，检测精液颜色、气味、密度、精子活率。本试验使用的精液在37℃条件下原精活率0.8以上，无色或白色云雾状无异味，精子密度为密的精液。2.1.2试验方法2.1.2.1稀释液的配制按照表2-1，利用电子天平准确称取原料，配置稀释粉。用双蒸水溶解4种稀释粉，在溶解时，可将稀释液置于37℃水浴锅中，利用玻璃棒不停地搅拌，加速溶解。溶解完全时，静置30min~1h，利用0.22μm滤膜，过滤稀释液，放于37℃水浴锅中静置平衡。过滤的主要目的是，降低精液稀释液中微生物数量，使稀释液更稳定。稀释前1h左右加入4×105IU/L的庆大霉素作为抗生素。表2-1自配猪精液常温保存稀释液配方（单位：g/L）Table2-1Composition(ing/L)ofdifferentextendersusedforliquidstorageofboarsemen稀释液Extender配方成分稀释液1稀释液2稀释液3稀释液4ComponentExtender1Extender2Extender3Extender4葡萄糖3011.54025Glucose柠檬酸钠611.56.86Sodiumcitrate碳酸氢钠1.21.30.81.25SodiumbicarbonateEDTA1.321.52柠檬酸—30.32.7Citricacid氯化钾——0.7—PotassiumchlorideTris24.75—62.1.2.2精液的稀释将采集的符合试验要求的精液平均分成4组，每组3个重复，利用温度计测定原精温度，将稀释液温度调整到与原精温差小于1℃，以免稀释时对精子质膜造成伤害。稀释精液时，缓慢的将稀释液倒入原精中。精液稀释时先1:1稀释，根据低倍稀释后精液密度，进行高倍稀释。本试验中精液与稀释液稀释比例为1:4。将稀释好的精液用3层 第二章猪精液常温保存基础稀释剂研究13毛巾包裹，置于室内缓慢降温，待降至室温时，将其保存于17℃恒温箱中。在精液常温保存过程中每12h翻动一次精液。2.1.3检测指标及方法每24h检测精子活率、质膜完整率、顶体完整率。2.1.3.1精子活率用微量移液器吸取各试验组精液30μL，利用37℃恒温加热板加热，在400倍光学显微镜下观察精子活率。本试验每个试验组随机观察3个视野，统计每个视野下，直线运动的精子数占视野内总精子数比例（张忠诚2006），即为活率。在人工授精时使用的常温保存条件猪精液活率要求不得低于0.6。2.1.3.2精子有效保存时间精子活率不低于0.6时的保存时间。2.1.3.3质膜完整率从各试验组中吸取1mL精液，分别加入9mL柠檬酸钠-果糖低渗液，在37℃条件下水浴30min，然后，用微量移液器吸取一滴，在400倍光学显微镜下观察精子弯尾率。计算在200个精子中尾部弯曲的精子所占比例。注意，水浴孵化时，要不停的轻晃试管，以免精子沉积，造成膜损伤，影响结果。2.1.3.4顶体完整率从各试验组中吸取30μL精液，制作抹片，自然干燥后，利用福尔马林溶液固定30min，水洗风干后，用姬穆萨染液染色2h，用流水缓慢冲去玻片表面浮色，自然干燥后，在1000倍油镜下观察。统计200个精子中顶体完整的精子数量，计算顶体完整率。2.1.4统计分析试验数据用SPSS19.0统计软件进行显著性检验，结果均以“平均值±标准差”表示。2.2结果与分析2.2.1自配稀释液对猪精子活率的影响自配稀释液对猪精子活率的影响见表2-2。 14不同精子质膜保护剂对猪精液常温保存效果的影响表2-2自配稀释液对猪精子活率的影响Table2-2Effectsofself-madeextendersonboarspermmotility保存时间/d稀释液ExtenderConservation稀释液1稀释液2稀释液3稀释液4TimeExtender1Extender2Extender3Extender400.74±0.0560.75±0.0410.79±0.0450.77±0.07810.69±0.034b0.71±0.027ab0.76±0.024a0.72±0.040ab20.65±0.0370.70±0.0480.73±0.0270.69±0.05730.59±0.074b0.63±0.038ab0.67±0.057a0.62±0.027ab40.53±0.0760.54±0.0730.61±0.0810.58±0.044有效保存时间/dEffective2.38±0.650c3.22±0.985b4.40±0.547a3.60±0.833bcsurvivaltime注：同行数据肩标不同小写字母表示差异显著（P<0.05），相同字母表示差异不显著（P>0.05）。Note:differentlettersinthesamerowindicatesignificantdifferences(P<0.05),andthesameletterindicatenotsignificant(P>0.05).由表2-2可知，在第1d和第3d时，“稀释液3”稀释的精液，精子活率显著高于其他3种稀释液（P<0.05）。“稀释液3”的保存时间最长，显著高于其他稀释液（P<0.05）。“稀释液2”和“稀释液4”稀释的精液精子活率差异不显著（P>0.05），但都显著高于“稀释液1”稀释的精液（P<0.05）。“稀释液1”稀释的精液活率在第1d和第3d时显著低于其他3组稀释液（P<0.05），有效保存时间也显著低于其他三组稀释液（P<0.05）。2.2.2自配稀释液对猪精子质膜完整率的影响自配常温稀释液对猪精子质膜完整率的影响见表2-3。表2-3自配稀释液对猪精子质膜完整率的影响（%）Table2-3Effectsofself-madeextendersonboarspermplasmamembraneintegrity(%)保存时间/d稀释液ExtenderConservation稀释液1稀释液2稀释液3稀释液4TimeExtender1Extender2Extender3Extender4068.65±3.16b71.18±3.11ab77.60±2.57a73.55±4.40ab164.03±1.12b64.25±3.41b71.62±2.65a65.60±5.35ab261.20±1.27b60.30±2.29b66.47±3.02a64.17±2.1ab356.02±3.88b57.87±2.72b63.91±2.48a59.10±2.31ab450.92±3.7954.51±2.9657.32±2.0656.15±2.85注：同行数据肩标不同小写字母表示差异显著（P<0.05），相同字母表示差异不显著（P>0.05）。Note:differentlettersinthesamerowindicatesignificantdifferences(P<0.05),andthesameletterindicatenotsignificant(P>0.05).由表2-3可知，保存第0~3d，“稀释液3”稀释的精液的质膜完整率明显高于其他试验组（P<0.05）。保存第1~3d，“稀释液1”和“稀释液2”稀释的精液质膜完 第二章猪精液常温保存基础稀释剂研究15整率显著低于“稀释液4”的（P<0.05），但其组间相互差异性不显著（P>0.05）。保存到第4d时，“稀释液3”的质膜完整率最高，其次是“稀释液4”，再是“稀释液2”，最差的是“稀释液1”。2.2.3自配稀释液对猪精子顶体完整率的影响自配常温稀释液对猪精子顶体完整的影响见表2-4。表2-4自配稀释液对猪精子顶体完整率的影响（%）Table2-4Effectsofself-madeextendersonboarspermacrosomeintegrity(%)保存时间/d稀释液ExtenderConservation稀释液1稀释液2稀释液3稀释液4TimeExtender1Extender2Extender3Extender4087.22±2.95b88.96±1.85ab91.52±3.74a89.10±3.23ab183.95±2.47b86.02±2.31ab87.05±1.58a85.40±3.81ab280.32±1.78b83.32±1.89ab85.30±3.18a84.07±1.73ab375.42±2.25b79.10±1.26ab81.77±2.55a78.40±1.72ab470.85±1.06b75.75±1.12a78.12±1.56a75.60±2.17a注：同行数据肩标不同小写字母表示差异显著（P<0.05），相同字母表示差异不显著（P>0.05）。Note:differentlettersinthesamerowindicatesignificantdifferences(P<0.05),andthesameletterindicatenotsignificant(P>0.05).由表2-4可知，保存到第0~3d时，“稀释液3”稀释的精液顶体完整率显著高于其他试验组（P<0.05），“稀释液2”和“稀释液4”的顶体完整率显著高于“稀释液1”（P<0.05），但其组间相互差异性不显著（P>0.05）；保存第4d时，“稀释液1”的顶体完整率显著低于其他稀释液（P<0.05），且其他试验组间差异不显著（P>0.05）。2.3讨论2.3.1稀释液不同成分对猪精液常温保存效果的影响猪精液稀释液主要通过为精子体外新陈代谢提供营养物质、缓冲物质、保护剂等，保证精子质量（Gadea2003）。稀释液中所含有的各种物质起着不同作用。葡萄糖是稀释液中主要的能量物质，也是维持稀释液渗透压的重要物质（高飞等2004）。精子可耐受240~330mosM的渗透压，等渗或是稍高渗的条件下，有助于延长精液有效保存时间（胡建宏等2013）。本试验中使用的自配稀释粉主要成分包括葡萄糖、柠檬酸钠、碳酸氢钠和EDTA，柠檬酸、Tris、氯化钾是选择性添加，4种自配稀释液各化学物质质量分数各不相同，保存效果差异性较大。通过分析可知，“稀释液3”的保存效果最好，“稀释液1”的常温保存效果最差。造成这一结果的可能性因素是，“稀释液3”葡萄糖含量最高，其稀释液渗透压可能适宜精子常温保存，且为精子常温保存过程中提供的营养物质最充分，而其配方中添加了氯化钾，对延长精子保存时间，提高精子质量有明显作用，这与张坚中等（1998）研究结果一致。“稀释液1”的成分中无柠檬酸和氯化 16不同精子质膜保护剂对猪精液常温保存效果的影响钾，葡萄糖其他成分含量与BTS相类似（Pursel1975），但有效保存时间只有2.38d，可能因为其pH调节能力较差，通过精子质膜完整率和顶体完整率可知，其渗透压可能超过精子耐受范围，破坏精子质膜完整性。“稀释液2”中葡萄糖含量最低，只有11.5g/L，但其保存效果较“稀释液3”差，但显著高于“稀释液1”（P<0.05），可能是因为其含有11.5g/L的柠檬酸钠，不仅可以维持pH稳定，还能调节精子质膜内外离子浓度，维持精子质膜内外电荷平衡，降低精子凝集造成的精子质膜损伤。猪精液常温保存稀释液加入过高的葡萄糖会使稀释液渗透压过高，造成精子顶体蛋白损伤脱落，而加入的葡萄糖不足，会导致稀释液中营养物质不足维持精子保存过程中新陈代谢需要，也会由于渗透压过低而使精子畸形，都会影响人工授精效果。猪原精呈弱碱性，稀释液pH在6.4~6.9范围内时，对延长猪精液常温保存时间效果最好（林峰等2012）。柠檬酸、柠檬酸钠、Tris、碳酸氢钠等是稀释液中调节pH的主要物质，稳定精液pH，中和精子新陈代谢产生的酸性物质（Kim等2000）。氯化钾是一种膜保护剂，对维持精子膜上Na+-K+-ATP酶活性有重要作用，外源性补充一定量的K+可以弥补精子膜内K+的流失，产生ATP，为精子新陈代谢提供能量（Johnsonetal.2000）。EDTA是与稀释液内金属离子结合的螯合剂，能过降低稀释液金属离子的含量，尤其是Ca2+浓度，维持精子质膜稳定性，防止诱发获能，保持顶体完整性（Harrison1996）。抗生素可以抑制精液稀释液后细菌的生长，以免微生物代谢产物造成精子损伤。研究发现，稀释粉中加入400IU/mL的庆大霉素对猪精液常温保存效果加好（潘红梅2007）。2.3.2自配稀释液对猪精子活率、顶体完整率、质膜完整率的影响精子活率是指直线运动精子数占总精子数的比例，是精液品质鉴定的重要指标，反映的是精子运动能力，与精子受精能力有相关性（杨浩宇2013）。精子质膜有维持精子内环境完整性、精子代谢过程中物质转运、受精过程传递信号等功能。精子顶体能够帮助精子发生顶体反应，精子获能，穿过卵子透明带（Yietal.2004），其完整性是衡量精子繁殖能力的重要指标。猪精液品质和人工授精效果与这三种指标呈显著正相关（P<0.05）。本试验中“稀释液3”精子活率、质膜完整率、顶体完整率、精子有效保存时间显著高于其他试验组，其有效保存时间为4.4d，第4d的精子活率为0.63，质膜完整率是57.32%，顶体完整率是78.12%。精子活率较高但顶体损坏，也是会影响人工授精受胎率。葡萄糖和无机盐离子可以调节精子质膜内外渗透压，防止低渗造成精子吸水肿胀，破坏精子质膜完整性；高渗造成精子失水，影响精子运动能力和人工授精效果。EDTA对Ca2+为主的金属离子的螯合作用显著，可以降低精液中Ca2+对精子顶体和质膜的破坏。Ca2+可以通过精子质膜进入精子，催化顶体反应。金属离子还能催化精子质膜上不饱和脂肪酸的氧化作用，破坏精子形态学完整性。本试验中“稀释液3”可能是因为其各稀释粉成分配比渗透压、pH适中，EDTA的保护作用，使运动性能、质膜、顶体都得到更好地营养和保护。 第二章猪精液常温保存基础稀释剂研究172.4小结“稀释液3”保存效果最好，其有效保存时间为4.4d，第4d的精子活率为0.61，质膜完整率是57.32%，顶体完整率是78.12%。其次是“稀释液2”和“稀释液4”，保存效果最差是“稀释液1”。 18不同精子质膜保护剂对猪精液常温保存效果的影响第三章氨基酸类保护剂（牛磺酸和L-谷氨酰胺）对猪精液常温保存效果的影响前言在精液的保存过程中，精液品质降低与呼吸代谢过程中产生的活性氧族（ROS）有关（Bilodeauetal.2002）。猪精液中不饱和脂肪酸（PUFA）含量将高，在抗氧化酶活性较低时，高浓度的ROS会氧化PUFA造成精子脂质过氧化（LOP），破坏精子质膜结构，降低精子活率，影响精子受精能力（Wai-Sumetal.2006）。同时，质膜通透性遭到一定损伤，会引起Ca+内流进入镜子膜内，催化精子发生顶体反应，影响精子受精能力。牛磺酸（taurine，Tau），化学名称为β-氨基乙磺酸，是一种含硫的游离氨基酸，主要与胚胎发育、提高视力、为中枢神经系统提供营养、乳化脂肪、促进脂肪代谢、保护肝脏、抗肿瘤等药理作用。有研究表明，牛磺酸可通过双向调节细胞膜上Ca+，调节细胞膜对阳离子的通透性，保护膜上磷脂层完整性，降低细胞内氧自由基水平，增强抗氧化酶活性对细胞起保护作用。有研究表明，牛磺酸对精液保存有一定的影响。Foote等（1993）研究报道，牛的冷冻精液中添加23.97mM的牛磺酸，显著增强精子质膜完整率。Michael等（2004）研究发现，在犬精液稀释液中添加0.2mM的牛磺酸可明显提高精液保存效果。李文烨（2007）研究表明，添加1mM的亚牛磺酸可以显著增强猪冷冻精液中精子质膜、顶体完整率。L-谷氨酰胺（L-Glutamine，Gln）是机体“条件性必需氨基酸”，具有重要的生物学功能：为糖、蛋白质、核酸合成代谢提供氮源；合成抗氧化酶谷胱甘肽（GSH）（乔玉成，田野2002）；促进机体氮排泄，降低体内氮毒素；促进胰岛素分泌，降低血糖；治疗神经性疾病。谷氨酰胺可作为冷冻保护剂对猪冷冻精子活率有提高作用（Renardetal.1996）。张树山等（2013）研究发现，猪冷冻精液中添加40mM的谷氨酰胺对猪冷冻精子保护效果较好。牛磺酸和L-谷氨酰胺是两种哺乳动物体内重要的游离氨基酸，氨基酸具有调节细胞渗透压、抗氧化的特性，可增强冷冻精液保存效果，但对猪精液常温保存效果的影响报道较少。为研究牛磺酸（Tau）和L-谷氨酰胺对猪精液常温保存效果的影响，本试验通过在自配稀释剂中分别添加0、0.5、1、5、10mmol/L的牛磺酸以0、0.5、1、2、4、8、16mmo/L的L-谷氨酰胺，通过检测精子活率、顶体完整率、质膜完整率、总抗氧化能力（T-AOC）、丙二醛（MDA）浓度，研究牛磺酸和L-谷氨酰胺在猪精液常温保存中最适添加量，优化自配稀释剂配方，延长保存时间。 第三章氨基酸类保护剂（牛磺酸和L-谷氨酰胺）对猪精液常温保存效果的影响193.1材料与方法3.1.1试验材料3.1.1.1试验试剂试验试剂同第二章。3.1.1.2试验仪器试验仪器同第二章。3.1.1.3精液来源精液来源同第二章。3.1.2试验方法3.1.2.1稀释液的配制稀释前2h按表2-1，称取“稀释液3”作为基础稀释液：葡萄糖40g/L，柠檬酸钠6.8g/L，碳酸氢钠0.8g/L，EDTA1.5g/L，柠檬酸0.3g/L，氯化钾0.7g/L。准确量取双蒸水，在37℃下水浴加热溶解，待完全溶解后，将稀释液中分别添加0.5、1、5、10mmol/L的牛磺酸；0.5、1、2、4、8、16mmo/L的L-谷氨酰胺作为试验组，设置空白对照组，再利用0.22μm滤膜过滤稀释液，加入4×105IU/L的庆大霉素。37℃下水浴静置30min-1h。3.1.2.2精液的稀释精液稀释方法同第二章。3.1.3检测方法3.1.3.1精子活率精子活率检测方法同第二章。3.1.3.2质膜完整率质膜完整率检测方法同第二章。3.1.3.3顶体完整率顶体完整率检测方法同第二章。3.1.3.4T-AOC与MDA分别测定保存第0d、第1d、第3d和第5d的精液中的T-AOC和MDA浓度，测定方法按照南京建成生物公司试剂盒说明书进行。3.1.4统计分析统计分析方法同二章。 20不同精子质膜保护剂对猪精液常温保存效果的影响3.2结果与分析3.2.1Tau对猪精液常温保存精液品质的影响3.2.1.1Tau对猪精子活率的影响不同浓度的Tau对猪精子活率的影响见表3-1。表3-1不同浓度Tau对猪精子活率的影响Table3-1EffectsofdifferentconcentrationsofTauonboarspermmotility保存时间/dTau/(mmol/L)Conservation00.51510Time00.79±0.0450.81±0.0280.78±0.0200.79±0.0130.76±0.01910.76±0.024a0.73±0.016ab0.75±0.012a0.76±0.011a0.71±0.025b20.73±0.0270.72±0.0310.72±0.0290.73±0.0540.68±0.02430.67±0.0570.68±0.0200.69±0.0110.70±0.0140.66±0.0440.61±0.0810.62±0.0220.65±0.0330.67±0.0400.64±0.03150.55±0.040c0.58±0.027bc0.63±0.024ab0.66±0.024a0.60±0.024bc60.45±0.058b0.52±0.025ab0.49±0.025ab0.56±0.035a0.51±0.043ab注：同行数据肩标不同小写字母表示差异显著（P<0.05），相同字母表示差异不显著（P>0.05）。Note:differentlettersinthesamerowindicatesignificantdifferences(P<0.05),andthesameletterindicatenotsignificant(P>0.05).由表3-1可知，添加0.5~10mmol/L的Tau时，精子活率随着添加量的升高而出现先增加后降低的趋势。保存第1d以及第5~6d时，添加5mmol/L的Tau的精子活率显著高于其他试验组(P<0.05）。3.2.1.2Tau对猪精子质膜完整率的影响不同浓度的Tau对猪精子质膜完整率的影响率见表3-2。表3-2不同浓度Tau对猪精子质膜完整率的影响（%）Table3-2EffectsofdifferentconcentrationsofTauonboarspermplasmamembraneintegrity(%)保存时间/dTau/(mmol/L)Conservation00.51510Time077.60±2.5775.65±2.1876.10±2.6575.55±1.9876.22±3.08171.67±2.65b71.95±1.64b71.32±1.05b74.87±2.65a71.50±1.78b266.47±3.02b64.97±2.81b66.45±0.91b72.12±1.51a61.05±0.96c361.91±2.48ab61.42±0.78b62.15±1.84a62.42±1.92a59.27±1.32b457.32±2.06a58.12±2.25a56.57±2.58a57.31±2.45a54.57±2.41b543.07±4.19ab40.77±2.30b48.52±1.53a47.48±4.49a46.25±3.63ab注：同行数据肩标不同小写字母表示差异显著（P<0.05），相同字母表示差异不显著（P>0.05）。Note:differentlettersinthesamerowindicatesignificantdifferences(P<0.05),andthesameletter 第三章氨基酸类保护剂（牛磺酸和L-谷氨酰胺）对猪精液常温保存效果的影响21indicatenotsignificant(P>0.05).由表3-2可知，加入0~10mmol/L的Tau时，精子质膜完整率随添加浓度的增加而出现先增加后降低的趋势。保存第1~2d时，添加5mmol/L的Tau，猪精子质膜完整率显著高于其他组（P<0.05），保存第3~5d时，添加1mmol/L和5mmol/L的Tau对猪精子质膜完整率显著高于其他试验组（P<0.05），但组间差异不显著（P>0.05）。3.2.1.3Tau对猪精子顶体完整率的影响不同浓度的Tau对猪精子顶体完整率见表3-3。表3-3不同质量浓度Tau对猪精子顶体完整率的影响（%）Table3-3EffectsofdifferentconcentrationsofTauonboarspermacrosomeintegrity(%)保存时间/dTau/(mmol/L)Conservation00.51510Time091.52±3.74ab94.6±3.58a91.00±1.33ab92.60±2.38ab90.37±1.78b187.05±1.58a88.17±1.48a89.21±1.41a90.87±2.37a84.9±1.30b285.30±3.18ab84.13±1.20ab85.95±1.05a86.73±1.82a81.42±1.33b381.97±2.55ab82.13±1.83ab82.05±1.24ab83.32±2.16a75.95±2.09b478.47±1.56ab79.07±1.44ab77.30±1.35ab80.55±2.12a71.82±1.15b563.82±2.47c68.37±2.15b69.55±1.67ab72.10±1.96a64.25±1.95c注：同行数据肩标不同小写字母表示差异显著（P<0.05），相同字母表示差异不显著（P>0.05）。Note:differentlettersinthesamerowindicatesignificantdifferences(P<0.05),andthesameletterindicatenotsignificant(P>0.05).由表3-3可知，添加0~10mmol/L的Tau时，精子顶体完整率随着添加浓度的增加而出现先增加后降低的趋势。保存第1d时，添加0.5~5mmol/L的Tau，精子顶体完整率显著高于其他试验组（P<0.05），但组间差异不显著（P>0.05）；保存第2d时，添加1mmol/L和5mmol/L的Tau，精子顶体完整率显著高于其他试验组（P<0.05），但组间差异不显著(P>0.05）；保存第3~5d时，添加5mmol/L的Tau，精子顶体完整率显著高于其他试验组（P<0.05）。3.2.2Tau对猪精液中T-AOC和MDA浓度的影响不同浓度的Tau对对猪精液T-AOC和MDA浓度的影响分别见表3-4和表3-5。 22不同精子质膜保护剂对猪精液常温保存效果的影响表3-4不同浓度Tau对精液中T-AOC浓度的影响（IU/mL）Table3-4EffectsofdifferentconcentrationsofTauontheconcentrationofT-AOCinboarsemen（IU/mL）保存时间/dTau/(mmol/L)Conservation00.51510Time04.07±0.588b6.47±0.469a4.98±0.471ab5.98±0.520ab4.25±0.470b19.72±0.147b11.19±0.374a11.21±0.275a9.91±0.282b11.33±0.375a33.98±0.250b5.32±0.203ab5.52±0.193ab6.08±0.243a5.54±0.298ab53.34±0.331c4.09±0.363ab3.81±0.273ab4.28±0.326a4.30±0.383a注：同行数据肩标不同小写字母表示差异显著（P<0.05），相同字母表示差异不显著（P>0.05）。Note:differentlettersinthesamerowindicatesignificantdifferences(P<0.05),andthesameletterindicatenotsignificant(P>0.05).表3-5不同浓度Tau对精液中MDA浓度的影响(nmol/mL)Table3-5EffectsofdifferentconcentrationsofTauontheconcentrationofMDAinboarsemen（nmol/mL）保存时间/dTau/(mmol/L)Conservation00.51510Time01.02±0.1551.07±0.1091.04±0.1941.08±0.1981.11±0.27011.51±0.336a1.55±0.118a1.55±0.281a1.11±0.231c1.24±0.218bc31.69±0.370a1.72±0.300a1.78±0.119a1.41±0.281b1.56±0.238ab51.75±0.247bc2.97±0.316a3.04±0.289a1.63±0.225c3.68±0.287a注：同行数据肩标不同小写字母表示差异显著（P<0.05），相同字母表示差异不显著（P>0.05）。Note:differentlettersinthesamerowindicatesignificantdifferences(P<0.05),andthesameletterindicatenotsignificant(P>0.05).由表3-4和表3-5可知，随着保存时间的延长，各试验组精液中总抗氧化能力在保存第1d时增强，后降低，MDA浓度逐渐升高。由表3-4可知，保存第1d时，空白对照组与添加5mmol/L的Tau组，精液中T-AOC浓度低于其他试验组，但组间差异不显著（P>0.05）；保存第3d时，添加5mmol/L的Tau，精液中T-AOC浓度显著高于其他组（P<0.05）；保存第5d时，添加5mmol/L和10mmol/L的Tau，精液中T-AOC浓度显著高于其他组（P<0.05），但组间差异不显著（P>0.05）。由表3-5可知，保存第1~5d，添加5mmol/L的Tau，精液中MDA浓度为显著低于其他组（P<0.05）；保存第1~5d时，添加0.5mmol/L和1mmol/L的Tau，精液中MDA浓度显著高于其他试验组（P<0.05），但与空白对照组差异不显著（P>0.05）。3.2.3Gln对猪精液常温保存精液品质的影响3.2.1.1Gln对猪精子活率的影响不同浓度的Gln对猪精子活率的影响见表3-6。 第三章氨基酸类保护剂（牛磺酸和L-谷氨酰胺）对猪精液常温保存效果的影响23表3-6不同浓度Gln对猪精子活率的影响Table3-6EffectsofdifferentconcentrationsofGlnonboarspermmotility保存时间/dGln/(mmol/L)Conservation00.5124816Time00.79±0.0450.77±0.0510.75±0.0430.79±0.0400.76±0.0480.76±0.0410.75±0.0371a0.74±0.045ab0.72±0.041ab0.75±0.034ab0.72±0.041ab0.74±0.043ab0.70±0.036b0.76±0.02420.73±0.027a0.71±0.033a0.70±0.030ab0.71±0.036a0.73±0.040a0.67±0.024b0.67±0.024b30.67±0.057ab0.66±0.040ab0.67±0.037ab0.68±0.056ab0.70±0.042a0.65±0.050b0.65±0.034b4ab0.60±0.047ab0.63±0.041ab0.63±0.037ab0.64±0.037a0.61±0.038ab0.60±0.031b0.61±0.08150.55±0.040bc0.56±0.027ab0.54±0.024bc0.55±0.035bc0.59±0.032a0.53±0.026bc0.52±0.023c注：同行数据肩标不同小写字母表示差异显著（P<0.05），相同字母表示差异不显著（P>0.05）。Note:differentlettersinthesamerowindicatesignificantdifferences(P<0.05),andthesameletterindicatenotsignificant(P>0.05).由表3-6可知，每天的精子活率不随Gln的添加浓度的增加呈现规律性。其中，保存第1d时，空白组精子活率显著高于其他试验组（P<0.05），添加0.5~8mmol/L的Gln，精子活率差异不显著（P>0.05）；保存第2d时，添加0.5mmol/L、2mmol/L、4mmol/L的Gln，精子活率显著高于其他试验组（P<0.05），但组间差异不显著（P>0.05)；保存第3~5d时，添加4mmol/L的Gln，精子活率显著高于其他试验组（P<0.05）。3.2.1.2Gln对猪精子质膜完整率的影响不同浓度的Gln对猪精子质膜完整率的影响率见表3-7。表3-7不同浓度Gln对猪精子质膜完整率的影响（%）Table3-7EffectsofdifferentconcentrationsofGlnonboarspermplasmamembraneintegrity(%)保存时间/dGln/(mmol/L)Conservation00.5124816Time077.60±2.57ab72.32±2.19d72.60±1.69d78.55±2.41a75.95±2.21abc74.17±4.28bc74.18±1.74bc171.67±2.65ab70.87±2.73ab71.82±3.45ab70.42±1.69ab74.97±2.43a71.85±2.72ab68.71±2.75b266.47±3.02ab67.87±2.38ab68.82±1.36ab67.78±2.15ab70.81±4.75a70.37±1.93a62.67±3.21b361.91±2.48ab62.91±1.92ab55.52±1.96bc57.55±1.50b64.22±2.14a61.70±2.16ab53.42±1.84c457.32±2.06a54.77±1.51ab51.15±2.75cd53.03±2.97bc57.21±2.25a55.27±2.21ab48.17±1.33d543.07±4.19ab40.25±6.34bc40.37±2.76bc40.77±2.60bc47.05±2.86a39.20±1.86ab36.95±1.53c注：同行数据肩标不同小写字母表示差异显著（P<0.05），相同字母表示差异不显著（P>0.05）。Note:differentlettersinthesamerowindicatesignificantdifferences(P<0.05),andthesameletterindicatenotsignificant(P>0.05).由表3-7可知，每天的精子质膜完整率与Gln的添加浓度无规律性。保存第1~5d 24不同精子质膜保护剂对猪精液常温保存效果的影响时，添加4mmol/L的Gln，显著高于其他组（P<0.05）。但保存第0~5d，添加16mmol/L的Gln，精子质膜完整率显著低于其他组（P<0.05）。3.2.1.3Gln对猪精子顶体完整率的影响不同浓度的Gln对猪精子顶体完整率见表3-8。表3-8不同质量浓度Gln对猪精子顶体完整率的影响（%）Table3-8EffectsofdifferentconcentrationsofGlnonboarspermacrosomeintegrity(%)保存时间/dGln/(mmol/L)Conservation00.5124816Time091.52±3.7488.78±2.2587.72±1.3392.60±2.4190.87±1.1288.82±1.06b90.37±2.95ab87.47±2.07a86.60±1.73b87.60±1.73a87.37±2.60a86.35±1.81b86.87±2.15ab187.05±1.58285.30±3.18abc86.02±2.16ab84.27±1.44cd86.00±1.95ab88.25±2.55a85.77±2.24abc80.52±2.46d381.97±2.55bc85.90±2.45a82.60±1.61b84.22±1.81ab86.27±1.51a85.27±1.07ab75.45±2.80c478.47±1.56bc83.27±3.56bc79.87±2.61cd81.05±2.75ab84.05±1.24a79.25±1.10cd69.80±1.27d563.82±2.47c66.07±3.76c71.27±1.94ab72.87±2.89ab74.40±2.98a72.10±2.72ab66.47±2.28c注：同行数据肩标不同小写字母表示差异显著（P<0.05），相同字母表示差异不显著（P>0.05）。Note:differentlettersinthesamerowindicatesignificantdifferences(P<0.05),andthesameletterindicatenotsignificant(P>0.05).由表3-8可知，随着Gln的添加量的增加，精子顶体完整率不呈现规律性。当保存第1d时，添加0.5、2、4mmol/L的Gln，精子顶体完整率显著高于其他组（P<0.05），但组间差异不显著（P>0.05）；第2~5d时，添加4mmol/L的Gln，精子顶体完整率显著高于其他组（P<0.05），添加16mmol/L的Tau时，精子顶体完整率显著低于其他试验组（P<0.05）。3.2.4Gln对猪精液中T-AOC和MDA浓度的影响不同浓度的Gln对对猪精液T-AOC和MDA浓度的影响分别见表3-9和表3-10。表3-9不同浓度Gln对精液中T-AOC浓度的影响（IU/mL）Table3-9EffectsofdifferentconcentrationsofGlnontheconcentrationofT-AOCinboarsemen（IU/mL）保存时间/dGln/(mmol/L)Conservation00.5124816Timebaab4.02±0.187ba5.33±0.364abab04.07±0.5885.63±0.2215.17±0.1305.79±0.2145.30±0.415b11.10±0.304a10.79±0.403ab10.43±0.280ab11.21±0.341a10.49±0.398ab11.10±0.251a19.72±0.534b5.14±0.319ab5.19±0.234ab5.11±0.284ab5.17±0.189ab5.17±0.245ab5.91±0.386a33.98±0.250c4.03±0.242ab4.36±0.188a3.76±0.417bc4.34±0.144a4.35±0.232a4.28±0.381a53.34±0.331注：同行数据肩标不同小写字母表示差异显著（P<0.05），相同字母表示差异不显著（P>0.05）。Note:differentlettersinthesamerowindicatesignificantdifferences(P<0.05),andthesameletterindicatenotsignificant(P>0.05) 第三章氨基酸类保护剂（牛磺酸和L-谷氨酰胺）对猪精液常温保存效果的影响25表3-10不同浓度Gln对精液中MDA浓度的影响(nmol/mL)Table3-10EffectsofdifferentconcentrationsofGlnontheconcentrationofMDAinboarsemen（nmol/mL）保存时间/dGln/(mmol/L)Conservation00.5124816Time01.02±0.155b1.24±0.231b1.31±0.372b1.48±0.109b1.28±0.419b2.43±0.583a1.46±0.391b11.51±0.336ab1.56±0.304ab1.64±0.291a1.68±0.352a1.09±0.330b1.68±0.375a1.66±0.289a31.69±0.370ab1.59±0.201ab1.96±0.323a1.96±0.385a1.29±0.305b1.77±0.412ab1.98±0.264a51.75±0.247a1.61±0.224bc1.66±0.325bc1.75±0.372a1.51±0.230c1.67±0.205bc1.81±0.186a注：同行数据肩标不同小写字母表示差异显著（P<0.05），相同字母表示差异不显著（P>0.05）。Note:differentlettersinthesamerowindicatesignificantdifferences(P<0.05),andthesameletterindicatenotsignificant(P>0.05).由表3-9和表3-10可知，随着保存时间的延长，各试验组精液中总抗氧化能力在第1d时增强，在第3d和第5d时，逐渐下降；MDA浓度随着保存时间的延长出现先降低后增加的趋势。由表3-9可知，保存第1d和第5d时，添加4mmol/L和16mmol/L的Gln，精液中T-AOC浓度显著高于其他组（P<0.05），但组间差异不显著（P>0.05）；保存第3d时，添加16mmol/L的Gln，精液中T-AOC浓度显著高于其他组（P<0.05）。由表3-10可知，保存第1~5d时，添加4mmol/L的Gln，精液中MDA浓度显著低于其他组（P<0.05）。3.3讨论3.3.1Tau对猪精子活率、质膜完整率和顶体完整率的影响牛磺酸（taurine，Tau）是一种含巯基氨基酸，具有保护细胞质膜通透性、维持渗透压、消除自由基的作用。Tau对细胞膜的保护作用主要是通过调节细胞膜对Ca2+的通透性，当细胞内Ca2+浓度低于一定的浓度时，Tau能够增加细胞膜对Ca2+的结合位点，激活ATP酶的活性，促进钙离子内流；当Ca2+浓度超出其耐受范围，会抑制细胞膜对Ca2+的亲和性，刺激细胞器增加Ca2+的贮藏（刘维平2007）。Tau还可调节细胞内外渗透压，他主要通过调节离子的跨膜运动来维持渗透压稳定。Tau还能与细胞膜上磷脂消化降解有关，维持细胞膜的稳定性（Ruknudinetal.1989）。Foote等（1993）研究表明，在牛的冷冻精液中添加23.97mM的Tau，显著增强精子质膜完整率。Michael等（2004）研究发现，在犬精液稀释液中添加0.2mM的Tau可明显提高精液保存效果。李文烨（2007）研究表明添加1mM的亚牛磺酸可以显著增强猪冷冻精液中精子质膜、顶体完整率。在山羊精液低温保存过程中加入21mM的Tau可以增强精子活率和质膜完整率（赵本田，许常龙2007）。本试验研究结果表明，当加入0~5mmol/L的Tau时，随着添加剂量的增加，精子活率、质膜完整率、顶体完整率逐渐增加，但当添加10mmol/L的Tau时，精子活率、质膜完整率、顶体完整率显著降低，说明在一定浓度范围内，Tau对精子活率、 26不同精子质膜保护剂对猪精液常温保存效果的影响质膜完整率、顶体完整率的作用呈剂量依赖性，当超过一定浓度时，Tau会对精子造成伤害，可能原因是增加稀释液的渗透压，从而影响精子质膜通透性，破坏精子结构。在1~5d的保存时间内，添加5mmol/L的Tau，精子活率、质膜完整率、顶体完整率都显著高于同期其他组，本试验证明了牛磺酸对猪精液常温保存质膜形态学完整性的保护作用，但可能因为选取不同的动物品种，精液保存方式也不同，使得本试验研究结果与Michael等（2004）、李文烨（2007）的研究结果存在差异。3.3.2Tau对猪精液T-AOC和MDA浓度的影响在猪精液常温保存过程中，精子呼吸作用和新陈代谢会产生ROS，正常生理状态下，ROS会被精液中抗氧化酶还原消除，但随着保存时间的延长，猪精液内环境稳定性遭到破坏，严重影响抗氧化酶活性，由于ROS的产生-消除的平衡被破坏，造成ROS量增多，攻击猪精子质膜上的不饱和脂肪酸，发生脂质过氧化反应（Basimetal.2009），产生氧化产物丙二醛（MDA）。任俊玲等（2012）研究表明，精液中MDA浓度与精子氧自由基代谢程度呈正比，与精子抗氧化水平成反比。蒋建伟和严玉霞（1999）研究表明，Tau具有抗氧化作用，主要通过直接消除氧自由基中的过氧根离子；结合细胞组织中含次氯酸的代谢产物，生成胺类排出体外；增强抗氧化酶的活性，减缓机体运动氧化损伤（McLaughlinetal.2000）。本试验结果表明，随着保存时间的延长，精液中T-AOC浓度先增后降的趋势，在在保存第1d时，T-AOC浓度显著增强，添加0.5mmol/L、1mmol/L、10mmol/L的Tau，精液中T-AOC浓度分别为11.19IU/mL、11.21IU/mL、11.33IU/mL，显著高于其他组；保存第3d和第5d时，添加5mmol/L的Tau，精液中T-AOC浓度分别为6.08IU/mL和4.28IU/mL，显著高于其他组。保存第1~5d，添加5mmol/L的Tau，精液中MDA浓度为显著低于其他组。说明添加5mmol/L的Tau对消除氧自由基、提高抗氧化酶、降低MDA产生速率的作用显著，当添加浓度超过5mmol/L时，精液中MDA浓度增加，可能原因是，随着添加量的增多，Tau清除氧自由基、增强精液抗氧化酶的能力有限，精子的质膜由于渗透压变化出现损伤，引起脂质过氧化损伤加剧，因而，出现精液中氧化终产物之一的MDA浓度增长速度逐渐增强的现象。3.3.3Gln对猪精子活率、质膜完整率和顶体完整率的影响谷氨酰胺是机体内重要的必需氨基酸氨基酸，可以为蛋白质、核酸代谢提供氮源，还可发生氧化反应提供能量（Vanetal.1998）。金其贯和杨则宜（2003）研究表明，L-谷氨酰胺具有维持肠道稳定，增强免疫力、抗氧化等生物学作用。目前，L-谷氨酰胺广泛应用于医药、保健、食品等领域。L-谷氨酰胺作为一种重要的“条件限制性氨基酸”，其具有稳定精子质膜结构，预防精子冷打击造成质膜破损的功能，而被用于冷冻精液（Mercadoetal.2009）。Ahmad等（2008）研究报道了添加20~40mM的谷氨酰胺可显著提高鹿冷冻精液保存效果。本试验结果表明，随着添加Gln浓度的逐渐增加，精子活率、质膜完整率和顶体完整率的规律性不强，比较第2~5d精子活率、质膜完整率和顶体完整率可以发现，添加4mmol/L的Gln，精子活率、质膜完整率和顶体完整率显著高 第三章氨基酸类保护剂（牛磺酸和L-谷氨酰胺）对猪精液常温保存效果的影响27于其他组，添加16mmol/L的Gln，精子活率、质膜完整率和顶体完整率显著低于其他组。因此，最适添加量为4mmol/L，这与Ahmad等（2008）研究出的添加20~40mM的谷氨酰胺可显著提高鹿冷冻精液保存效果结果不一致，可能因为本试验选用猪精液，且保存方式为常温液态保存。在一定浓度范围内，Gln对猪精液品质的影响与浓度呈正相关，但超出这个范围，会对精子造成伤害，可能原因是，谷氨酰胺在细胞膜内外穿梭主要依靠Na+依赖性通道（张军民，高振川1999），外源性补充大量的Gln会对细胞膜通透性有影响，破坏精子质膜稳定性。3.3.4Gln对猪精液T-AOC和MDA浓度的影响L-谷氨酰胺是合成谷胱甘肽的重要原料，可以增强精液内谷胱甘肽还原酶的活性（张伟等2011）。GSH抗氧化原理为：第一，GSH可以催化GSH-PX活性，清除细胞内的H2O2，切断LOP循环链；第二，GSH可直接清除自由基，从H2O2和氧自由基夺取电子，使其还原成H2O；第三，GSH可保护细胞膜PUFA形成稳定的化合物，使之免受ROS攻击（段洪云等2013）给小鼠体内补充504.9~687.3μmol/L的谷胱甘肽，可显著提高血液中谷胱甘肽还原酶和谷胱甘肽氧化酶的含量（于建春等1996）。对过度运动者补充外源性谷氨酰胺，可以增加血液内GSH合成所需原料，提高GSH的抗氧化能力，降低MDA的产生，但对SOD无促进作用（乔玉成，田野2002）。因此，L-谷氨酰胺作为能源物质以及较强的抗氧化剂，可以提高机体缺氧耐受力，增强运动性，减少运动产生的酸性物质（石薇等2011）。氨基酸可以发挥冷冻保护作用（Renardetal.1996），但其单独使用时，冷冻保护效果不佳，需与甘油等易扩散性保护剂联用，对冷冻精液保存效果较好（Khilfaouietal.2005）。本试验结果表明，随着Gln添加量的增多，精液中T-AOC浓度在第1d时增强，在第3d和第5d时，逐渐下降，当添加1~16mmol/L的Gln时，MDA含量是随着Gln添加量的增加，先降低后增高。可能原因是，Gln对于体外氧化产物MDA产生的降低作用明显，与乔玉成和田野（2002）的研究结论一致。并且，当Gln的添加浓度超过4mmol/L时，其抑制MDA产生的功能才起作用，低于这一浓度，其抑制作用不明显。当保存第0~5d的精液中，添加16mmol/L的Gln，T-AOC的含量显著高于其他组，但其MDA浓度与试验组相比也较高。可能原因是，高浓度的Gln可以增加精液中GSH的含量，谷胱甘肽还原酶活性，但对于SOD、CAT的活性提高不显著，因而，制约了消除自由基的效率，造成氧化代谢产物MDA积累，破坏精子质膜。而添加4mmol/L的Gln，精液中T-AOC含量与添加16mmol/L的Gln组差异不显著，但显著高于其他试验组，MDA浓度显著低于其他组。所以，添加4mmol/L的Gln时，消除自由基的能力最强，抗氧化效果最强。虽然本试验表明稀释液中补充Gln能够提高常温保存的猪精子质量，增强精子抗氧化水平，但关于Gln对精子的保护机制还应进一步探索。 28不同精子质膜保护剂对猪精液常温保存效果的影响3.4小结“稀释液3”中添加5mmol/L的Tau可显著提高精液常温保存的精子活率、顶体完整率、质膜完整率、降低精液中MDA浓度，可明显增加精液中T-AOC浓度。“稀释液3”中添加4mmol/L的Gln可显著提高精液常温保存活率、顶体完整率、质膜完整率、T-AOC浓度、降低精液中MDA产生。 第四章中药保护剂（五味子乙素和三七皂甙R1）对猪精液常温保存效果的影响29第四章中药保护剂（五味子乙素和三七皂甙R1）对猪精液常温保存效果的影响前言目前，国内外对猪精液常温保存稀释液的研究主要集中在添加蛋白保护剂、抗生素、抗氧化剂等化学物质方面，局限了研究范围，使得对猪精液常温保存稀释剂的研究进展缓慢。因此，开发新型稀释剂或添加剂是猪精液常温保存领域亟待解决的问题。中药不仅是我国宝贵的物质资源，还是古代人民智慧的结晶，其天然、无污染、生物学功能丰富等特点，可以作为提高猪精液常温保存效果的添加剂。五味子乙素（SchisandrinB，SchB）是五味子果实中的一种活性物质，属于木脂素类，刘丽等（2011）研究表明，SchB具有保肝、护眼、抗肿瘤、抗氧化等药理作用。王蕾等（2006）研究表明，SchB可以降低过氧化氢对眼睛晶状体和视神经的伤害，保护细胞DNA完整性。SchB对机体内自由基清理能力较强，其抗氧化能力比维生素E和维生素C强（商红军等2012）。SchB还可与过氧化氢直接结合，起到机体抗氧化、抑制肝损伤的作用（闫荟羽等2014）。同时，还可增强抗氧化酶系统活性，尤其是谷胱甘肽氧化酶和谷胱甘肽还原酶的活性。SchB还可通过调节线粒体膜通透性，抑制Ca2+对细胞膜离子通道的敏感性（Puetal.2012），保护细胞质膜。SchB对抑制金黄色葡萄球菌和白色念珠杆菌抑制生长繁殖效果显著（李丽波等2013）。目前对五味子乙素作为抗氧化剂在精液保存中的应用报道较少。皂甙类物质具有提高细胞抗氧化能力，促进脂质代谢，降低脂质过氧化水平。研究表明黄芪皂甙可增加肝细胞内GSH的含量，增强抗氧化能力，显著降低了肝脏内MDA浓度（周世文等1995）。三七皂甙R1（NotoginsenosideR1）是从三七中提取的具有生物活性的物质三七总皂甙中的一种单体，它可以提高细胞内环磷酸腺苷浓度，增强机体细胞免疫的效果（刘艳娥等2008）。三七皂甙可对化学有机物引起的肝细胞氧化损伤有保护作用（沈惠云等2002）。其抗氧化作用原理是三七皂甙R1可以直接清除组织细胞内的游离氧，降低细胞膜的脂质过氧化损伤（赵鹏等2004）。但宋志斌等（2012）研究报道了三七皂甙对血清剥夺损伤的神经细胞具有较强的保护作用，对于体外消除自由基，增强体外细胞抗氧化能力有一定作用，但效果不显著。本试验通过分别在自配稀释液中添加不同浓度的SchB和三七皂甙R1，研究其对精子常温保存过程中活率、顶体完整性、质膜完整性、抗氧化性的影响，为五味子乙素（SchB）、三七皂甙R1在精液保存领域的应用推广提供数据支持。 30不同精子质膜保护剂对猪精液常温保存效果的影响4.1材料与方法4.1.1试验材料4.1.1.1试验试剂第一章筛选出的稀释液最佳保存效果配方“稀释液3”作为基础稀释液，分别在稀释液中加入0、1、5、10、15μmol/L的五味子乙素；0、1.25、2.5、5、10、20mmol/L的三七皂甙R1。4.1.1.2试验仪器试验仪器同第二章。4.1.1.3精液来源精液来源同第二章。4.1.2试验方法4.1.2.1稀释液的配制稀释前2h按表2-1，称取“稀释液3”作为基础稀释液：葡萄糖40g/L，柠檬酸钠6.8g/L，碳酸氢钠0.8g/L，EDTA1.5g/L，柠檬酸0.3g/L，氯化钾0.7g/L。准确量取双蒸水，在37℃下水浴加热溶解，待完全溶解后，将稀释液中分别添加1、5、10、15μmol/L的五味子乙素；1.25、2.5、5、10、20mmol/L的三七皂甙R1作为试验组，设置空白对照组，再利用0.22μm滤膜过滤稀释液，加入4×105IU/L的庆大霉素。37℃下水浴静置30min~1h。4.1.2.2精液的稀释精液稀释方法同第二章。4.1.3检测方法4.1.3.1精子活力精子活力检测方法同第二章。4.1.3.2质膜完整率质膜完整率检测方法同第二章。4.1.3.3顶体完整率顶体完整率检测方法同第二章。4.1.3.4T-AOC与MDA分别测定保存第0d、第1d、第3d和第5d的精液中的T-AOC和MDA浓度，测定方法按照南京建成生物公司试剂盒说明书进行。4.1.4统计分析统计分析方法同二章。 第四章中药保护剂（五味子乙素和三七皂甙R1）对猪精液常温保存效果的影响314.2结果与分析4.2.1五味子乙素对猪精液常温保存精液品质的影响4.2.1.1五味子乙素（SchB）对猪精子活率的影响不同浓度的五味子乙素（SchB）对猪精子活率的见表4-1。表4-1不同浓度SchB对猪精子活率的影响Table4-1EffectsofdifferentconcentrationsofSchBonboarspermmotility保存时间/dSchB（μmol/L）Conservation0151015Time00.79±0.0450.78±0.0340.76±0.0550.80±0.0450.78±0.06310.76±0.0240.73±0.0550.72±0.0480.73±0.0380.75±0.04020.73±0.0270.71±0.0570.69±0.0530.68±0.0600.73±0.03530.67±0.057ab0.64±0.062ab0.61±0.057b0.65±0.063ab0.71±0.043a40.61±0.081ab0.63±0.064a0.54±0.047b0.64±0.052a0.65±0.034a50.55±0.040b0.50±0.061c0.51±0.046c0.59±0.053b0.61±0.037a注：同行数据肩标不同小写字母表示差异显著（P<0.05），相同字母表示差异不显著（P>0.05）。Note:differentlettersinthesamerowindicatesignificantdifferences(P<0.05),andthesameletterindicatenotsignificant(P>0.05).由表4-1可知，保存第1~2d，添加0~15μmol/L的SchB精子活率组间差异不显著（P>0.05）；保存第3~5d时，添加15μmol/L时的SchB精子活率显著高于其他试验组（P<0.05）。4.2.1.2五味子乙素（SchB）对猪精子质膜完整率的影响不同浓度的五味子乙素（SchB）对猪精子质膜完整率的影响率见表4-2。表4-2不同浓度SchB对猪精子质膜完整率的影响（%）Table4-2EffectsofdifferentconcentrationsofSchBonboarspermplasmamembraneintegrity(%)保存时间/dSchB（μmol/L）Conservation0151015Time077.60±2.57ab75.65±2.58b74.41±1.59b79.61±2.63a76.37±1.93ab171.67±2.65ab69.47±2.02b70.83±1.51b74.72±2.43a74.67±1.72a266.47±3.02b61.37±1.79c60.95±2.02c69.45±1.96b72.75±1.92a361.91±2.48b56.45±2.62c57.17±1.52c62.65±1.75b66.68±2.51a457.32±2.06b48.52±2.26d52.07±5.15cd54.10±1.58bc63.32±2.27a543.07±4.19b40.02±2.07b45.00±2.42b43.78±4.65b50.71±2.65a注：同行数据肩标不同小写字母表示差异显著（P<0.05），相同字母表示差异不显著（P>0.05）。Note:differentlettersinthesamerowindicatesignificantdifferences(P<0.05),andthesameletterindicatenotsignificant(P>0.05).由表4-2可知，保存第0~1d时，添加10μmol/L和15μmol/L的SchB精子质膜完 32不同精子质膜保护剂对猪精液常温保存效果的影响整率显著高于其他试验组（P<0.05），但组间差异不显著（P>0.05）；保存第2~5d时，添加15μmol/L的SchB精子质膜完整率显著高于其他组（P<0.05）。4.2.1.3SchB对猪精子顶体完整率的影响不同浓度的SchB对猪精子顶体完整率见表4-3。表4-3不同质量浓度SchB对猪精子顶体完整率的影响（%）Table4-3EffectsofdifferentconcentrationsofSchBonboarspermacrosomeintegrity(%)保存时间/dSchB（μmol/L）Conservation0151015Time091.52±3.7490.37±2.4989.45±1.3590.47±3.6391.22±3.01187.05±1.58b88.57±1.93ab86.90±1.58b87.92±1.33ab88.87±1.32a285.30±3.18b86.67±1.08ab85.90±1.01ab85.12±5.03b87.37±5.03a381.97±2.55b83.67±2.79a83.55±1.47a84.35±2.27a83.85±3.38a478.47±1.56b81.12±1.31a80.95±4.01a80.57±3.39a82.65±1.49a563.82±2.47b71.42±3.06a68.60±3.36a69.85±1.42a70.91±1.54a注：同行数据肩标不同小写字母表示差异显著（P<0.05），相同字母表示差异不显著（P>0.05）。Note:differentlettersinthesamerowindicatesignificantdifferences(P<0.05),andthesameletterindicatenotsignificant(P>0.05).由表4-3可知，在精液中加入1~15μmol/L的SchB，精子顶体完整率显著高于空白组（P<0.05）。保存第1~2d时，添加15μmol/L的SchB，精子顶体完整率显著高于其他组（P<0.05），添加1μmol/L和10μmol/L的SchB精子顶体完整率差异不显著（P>0.05）；保存第3~5d时，添加1~15μmol/L的SchB，精子顶体完整率显著高于空白对照组（P<0.05），但组间差异不显著（P>0.05）。4.2.2五味子乙素对猪精液中T-AOC和MDA浓度的影响不同浓度的SchB对对猪精液T-AOC和MDA浓度的影响分别见表4-4和表4-5。表4-4不同浓度SchB对精液中T-AOC浓度的影响（IU/mL）Table4-4EffectsofdifferentconcentrationsofSchBontheconcentrationofT-AOCinboarsemen（IU/mL）保存时间/dSchB（μmol/L）Conservation0151015Time04.07±0.588ab3.23±0.456b3.23±0.256b4.46±0.355a3.97±0.228ab19.72±0.147b10.54±0.407b11.28±0.237ab12.83±0.155ab14.68±0.225a33.98±0.250b4.98±0.515b5.22±0.184b6.49±0.221ab7.85±0.237a53.34±0.331c4.28±0.240ab3.97±0.342b4.39±0.133ab4.82±0.249a注：同行数据肩标不同小写字母表示差异显著（P<0.05），相同字母表示差异不显著（P>0.05）。Note:differentlettersinthesamerowindicatesignificantdifferences(P<0.05),andthesameletterindicatenotsignificant(P>0.05). 第四章中药保护剂（五味子乙素和三七皂甙R1）对猪精液常温保存效果的影响33表4-5不同浓度SchB对精液中MDA浓度的影响(nmol/mL)Table4-5EffectsofdifferentconcentrationsofSchBontheconcentrationofMDAinboarsemen（nmol/mL）保存时间/dSchB（μmol/L）Conservation0151015Time01.02±0.1551.10±0.1621.09±0.2851.04±0.0890.94±0.22511.51±0.336a1.34±0.253a1.14±0.101b1.12±0.449b1.04±0.476b31.69±0.370a1.47±0.365ab1.39±0.124b1.35±0.285b1.33±0.124b51.75±0.247a1.67±0.257a1.70±0.161a1.50±0.304b1.45±0.288b注：同行数据肩标不同小写字母表示差异显著（P<0.05），相同字母表示差异不显著（P>0.05）。Note:differentlettersinthesamerowindicatesignificantdifferences(P<0.05),andthesameletterindicatenotsignificant(P>0.05).由表4-4和表4-5可知，随着保存时间的延长，各试验组精液中T-AOC浓度在保存第1d时增加，第3~5d时逐渐降低，精液中MDA的浓度逐渐升高。由表4-4可知，在同一时间条件，精液中T-AOC浓度随着SchB浓度的增加而增加，当添加15μmol/L的SchB时，其精液中T-AOC浓度显著高于其他组（P<0.05）。由表4-5可知，保存第1d和第3d时，添加5~15μmol/L的SchB，精液中MDA浓度显著低于其他组（P<0.05），但组间差异不显著（P>0.05）；当保存第5d时，添加10μmol/L和15μmol/L的SchB，精液内MDA浓度显著低于其他试验组（P<0.05），但组间差异不显著（P>0.05）。4.2.3三七皂甙R1对猪精液常温保存精液品质的影响4.2.3.1三七皂甙R1对猪精子活率的影响不同浓度的三七皂甙R1对猪精子活率的影响见表4-6。表4-6不同浓度三七皂甙R1对猪精子活率的影响Table4-6EffectsofdifferentconcentrationsofNotoginsenosideR1onboarspermmotility（%）保存时间/dNotoginsenosideR1（mmol/L）Conservation01.252.551020Time00.79±0.0450.77±0.0490.76±0.0630.79±0.0620.77±0.0320.76±0.06510.76±0.024a0.75±0.058ab0.73±0.065b0.73±0.058b0.72±0.033b0.74±0.067ab20.73±0.027a0.68±0.062c0.69±0.053bc0.70±0.068ab0.71±0.045ab0.72±0.049a30.67±0.057ab0.65±0.056b0.65±0.055b0.69±0.053a0.67±0.052ab0.65±0.028b40.61±0.081a0.60±0.037a0.61±0.032a0.65±0.035a0.63±0.041a0.52±0.063b50.55±0.040b0.55±0.041ab0.44±0.063c0.58±0.052a0.55±0.064ab0.49±0.025bc注：同行数据肩标不同小写字母表示差异显著（P<0.05），相同字母表示差异不显著（P>0.05）。Note:differentlettersinthesamerowindicatesignificantdifferences(P<0.05),andthesameletterindicatenotsignificant(P>0.05). 34不同精子质膜保护剂对猪精液常温保存效果的影响由表4-6可知，保存第0~2d时，空白对照组的精子活率显著高于试验组（P<0.05）；保存第3d和第5d时，添加5mmol/L的三七皂甙R1，精子活率显著高于其他试验组（P<0.05）；保存第4d时，添加20mmol/L的三七皂甙R1，精子活率显著低于其他组（P<0.05），其余各组间差异不显著（P>0.05）。4.2.3.2三七皂甙R1对猪精子质膜完整率的影响不同浓度的三七皂甙R1对猪精子质膜完整率的影响见表4-7。表4-7不同浓度三七皂甙R1对猪精子质膜完整率的影响Table4-7EffectsofdifferentconcentrationsofNotoginsenosideR1onboarspermplasmamembraneintegrity（%）保存时间/dNotoginsenosideR1（mmol/L）Conservation01.252.551020Time077.60±2.57ab75.83±2.11abc73.85±1.51c75.18±2.42c76.92±1.37abc79.00±2.43a171.67±2.65a69.27±1.88b71.67±1.69a71.85±1.55a70.25±1.16ab71.70±2.36a266.47±3.02ab64.85±2.82b68.71±2.39a68.85±1.22a66.37±2.21ab66.56±1.65ab361.91±2.48b57.62±2.48c56.00±1.23c66.70±1.92a62.37±2.76b62.00±1.44b457.32±2.06b54.70±2.31b56.50±5.78b64.10±1.16a55.82±1.92b56.30±1.22b543.07±4.19c50.90±2.23b47.72±1.78b57.10±3.18a40.45±1.89c42.37±2.76c注：同行数据肩标不同小写字母表示差异显著（P<0.05），相同字母表示差异不显著（P>0.05）。Note:differentlettersinthesamerowindicatesignificantdifferences(P<0.05),andthesameletterindicatenotsignificant(P>0.05).由表4-7可知，随着三七皂甙R1的添加量的增加，猪精液质膜完整率呈现先增大再降低的趋势。保存第1~2d时，添加2.5mmol/L和5mmol/L的三七皂甙R1，其精子质膜完整率显著高于其他组（P<0.05），但组间差异不显著（P>0.05）；保存第3~5d时，添加5mmol/L的三七皂甙R1，其精子质膜完整率显著高于其他组（P<0.05）。4.2.3.3三七皂甙R1对猪精子顶体完整率的影响不同浓度的三七皂甙R1对猪精子顶体完整率的影响见表4-8。表4-8不同浓度三七皂甙R1对猪精子顶体完整率的影响（%）Table4-8EffectsofdifferentconcentrationsofNotoginsenosideR1onboarspermacrosomeintegrity(%)保存时间/dNotoginsenosideR1（mmol/L）Conservation01.252.551020Time091.52±3.7491.17±2.0591.75±2.3292.20±1.4690.81±1.4191.07±2.13187.05±1.58ab85.06±2.61bc86.55±2.35bc87.25±1.67a85.85±4.18bc82.37±2.23c285.30±3.18a82.37±1.76ab83.02±2.37a85.20±2.24a84.47±2.13a79.931.22b381.97±2.55ab80.85±1.32ab80.20±2.67ab83.47±3.35a79.98±2.17b80.35±1.67b478.47±1.56ab75.77±2.35b73.52±3.42b80.15±2.38a73.12±2.73b76.30±2.89b563.82±2.47b71.37±3.05a69.12±2.79a73.70±2.72a70.05±4.38a68.15±3.06a注：同行数据肩标不同小写字母表示差异显著（P<0.05），相同字母表示差异不显著（P>0.05）。Note:differentlettersinthesamerowindicatesignificantdifferences(P<0.05),andthesameletterindicatenot 第四章中药保护剂（五味子乙素和三七皂甙R1）对猪精液常温保存效果的影响35significant(P>0.05).由表4-8可知，随着三七皂甙R1的添加量的增加，猪精液顶体完整率呈现先增大再降低的趋势。保存第1~4d，添加5mmol/L的三七皂甙R1，精子顶体完整率都显著高于其他组（P<0.05）；保存第5d时，添加1.25~20mmol/L的三七皂甙R1，精子顶体完整率显著高于空白对照组，但组间差异不显著（P>0.05）。4.2.4三七皂甙R1对猪精液中T-AOC和MDA浓度的影响不同浓度的三七皂甙R1对对猪精液T-AOC和MDA浓度的影响分别见表4-9和表4-10。表4-9不同浓度三七皂甙R1对精液中T-AOC浓度的影响（IU/mL）Table4-9EffectsofdifferentconcentrationsofNotoginsenosideR1ontheconcentrationofT-AOCinboarsemen（IU/mL）保存时间/dNotoginsenosideR1（mmol/L）Conservation01.252.551020Time04.07±0.588ab4.85±0.454a4.43±0.523a3.22±0.442b4.03±0.385ab4.10±0.224ab19.72±0.147b9.17±0.158c10.40±0.385a10.28±0.505a10.59±0.308a8.81±0.172c33.98±0.250d5.06±0.310c5.53±0.106ba5.16±0.285c3.73±0.273d6.87±0.21153.34±0.331c4.19±0.291b4.46±0.256a4.65±0.408a4.15±0.262b3.65±0.168c注：同行数据肩标不同小写字母表示差异显著（P<0.05），相同字母表示差异不显著（P>0.05）。Note:differentlettersinthesamerowindicatesignificantdifferences(P<0.05),andthesameletterindicatenotsignificant(P>0.05).表4-10不同浓度三七皂甙R1对精液中MDA浓度的影响(nmol/mL)Table4-10EffectsofdifferentconcentrationsofNotoginsenosideR1ontheconcentrationofMDAinboarsemen（nmol/mL）保存时间/dNotoginsenosideR1（mmol/L）Conservation01.252.551020Time01.03±0.1550.975±0.1090.977±0.1121.051±0.1710.930±0.0921.02±0.17811.59±0.336a1.29±0.134b1.29±0.103b1.22±0.266b1.18±0.198b1.39±0.215ab31.69±0.370bc1.56±0.146bc1.49±0.146c1.51±0.181c1.87±0.230b2.11±0.335a51.75±0.247b2.91±0.218a3.01±0.367a2.85±0.275a2.87±0.357a3.05±0.161a注：同行数据肩标不同小写字母表示差异显著（P<0.05），相同字母表示差异不显著（P>0.05）。Note:differentlettersinthesamerowindicatesignificantdifferences(P<0.05),andthesameletterindicatenotsignificant(P>0.05).由表4-9和表4-10可知，随着保存时间的延长，各试验组精液中T-AOC浓度随三七皂甙R1添加量的增加而呈现先升高再降低的趋势，同时，MDA的浓度随三七皂甙R1添加量的增加逐渐升高。由表4-9可知，保存第1d和第5d时，添加2.5mmol/L和5mmol/L的三七皂甙R1，精液中T-AOC的浓度显著高于其他组（P<0.05），但组间相互差异不显著（P>0.05）；第3d时，添加5mmol/L的三七皂甙R1，精液中T-AOC的 36不同精子质膜保护剂对猪精液常温保存效果的影响浓度显著高于其他组（P<0.05）。由表4-10可知，保存第1d时，添加1.25~10mmol/L的三七皂甙R1，精液中MDA含量会显著低于其他组（P<0.05），但组间相互差异不显著（P>0.05）；保存第3d时，添加5mmol/L和10mmol/L的三七皂甙R1，精液中MDA浓度显著低于其他组（P<0.05），但组间差异不显著（P>0.05）；保存第5d时，空白对照组精液中MDA浓度显著低于试验组（P<0.05），各试验组间差异不显著（P>0.05）。4.3讨论4.3.1五味子乙素对猪精液常温保存效果的影响目前，中药对精液保存方面的研究主要是关于提高冷冻精液保存效果的报道，猪精液常温保存研究较少。有研究报道，在猪冷冻精液中添加0.5mg/mL的绞股蓝多糖可提高精液品质（Huetal.2009）。红景天多糖可作为抗氧化剂提高冷冻精液的抗氧化酶系活性，增强其抗氧化能力，其最适添加量为4~8mg/L（李军伟2013）。在TCG稀释液中加入0.8mg/mL的昆布多糖和0.2mg/mL的丹参多糖，可以有效抑制猪冷冻精液中脂质过氧化反应（刘宏2010）。五味子乙素（SchisandrinB，SchB）对机体内自由基清理能力较强，尤其是消除含羟基自由基的能力比维生素E和维生素C强（商红军等2012），SchB可与过氧化氢直接结合，起到机体抗氧化、抑制肝损伤的作用（闫荟羽等2014）。同时，还可增强抗氧化酶系统活性，尤其是谷胱甘肽氧化酶和还原酶、磷酸脱氢酶的活性，其作用效果与SchB的添加剂量呈正相关（Ipetal.1995）。SchB还显著提高小鼠肝细胞中SOD和CAT的活性（周剑1992)。王蕾等（2006）研究表明，SchB可以降低过氧化氢对眼睛晶状体和视神经的伤害，保护细胞DNA完整性。SchB对抑制金黄色葡萄球菌和白色念珠杆菌抑制生长繁殖效果显著（李丽波等2013）主要作用机理不明确，可能是通过破坏细胞壁、细菌质膜以及细胞器结构，破坏细菌遗传物质完整性，抑制其生存繁殖；二是可能会通过作用于细菌中呼吸酶系统，抑制细菌有丝分裂（操庆国等2006）。Li等（2011）研究表明，加入0.25mg/mL的SchB对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠球菌、枯草芽孢杆菌抑菌效果最强。本试验结果可知，SchB对猪精液常温保存过程中精子活率、质膜完整率保护作用都随SchB的添加量的增加而增强，但对顶体完整率和精液中MDA浓度的影响无剂量差异性。当添加15μmol/L时的SchB时，精子活率、质膜完整率、精液中T-AOC浓度显著高于其他组。这是由于SchB的抗氧化性和细胞膜保护性，SchB提高精液在常温保存过程中消除氧自由基的能力，增强精子抗氧化酶活性，抑制脂质过氧化损伤，维持精子质膜完整性，这一结论与闫荟羽等（2014）研究一致，因此，证明了在猪精液常温保存稀释液中添加SchB对增强猪精液常温保存过程中精液抗氧化能力有明显作用。同时，随着添加量的增加，精子活率、质膜完整率、T-AOC浓度也逐渐增加，表明SchB可显著增加猪精液常温保存过程中精液品质，高剂量的SchB对精子伤害较小，表明SchB具有低毒性，与刘振（2011）的研究结果一致。SchB具有抑菌作用，也会抑制猪精 第四章中药保护剂（五味子乙素和三七皂甙R1）对猪精液常温保存效果的影响37液常温保存过程中微生物的繁殖，降低精液中微生物的毒性代谢产物，对保护精子质膜有作用。4.3.2三七皂甙R1对猪精液常温保存效果的影响三七皂甙R1（NotoginsenosideR1）属于具有抗氧化、改善肠道免疫力、增加脑部血液循环、保护心肌细胞等药理作用（苏静，朱卫泉2005）。三七皂甙可对化学有机物引起的肝细胞氧化损伤有保护作用（沈惠云等2002）。其抗氧化机制是：三七皂甙R1可以直接清除组织细胞内的游离氧，降低细胞膜的脂质过氧化损伤（赵鹏等2004）。董晓华等（2015）研究报道，三七皂甙R1不仅可以保护被H2O2损伤的大鼠神经元细胞，还可改善大鼠缺血再灌注造成的学习障碍。本试验结果表明，添加三七皂甙R1对猪精液常温保存前期的精子活率的影响作用不显著，对猪精液质膜完整率、顶体完整率、T-AOC浓度随着添加的三七皂甙R1的浓度的增多，而出现先增强后降低的趋势，各试验组精液中MDA的浓度差异不显著。当添加5mmol/L的三七皂甙R1精子质膜完整率、顶体完整率、T-AOC的浓度显著高于其他组。可能原因是，三七皂甙R1通过调节精子质膜内外Ca2+浓度，限制了精子质膜对Ca2+的通透性，防止Ca2+内流入精子内，使精子顶体获能，影响精液保存效果。当加入的三七皂甙R1浓度过高时（10~20mmol/L），精子活率、质膜完整率和顶体完整率、T-AOC浓度会下降，可能原因是，三七皂甙R1破坏精子质膜内外渗透压平衡，使精子质膜完整率降低；也可能是由于三七皂甙R1对精子质膜通透性的改变，使得稀释液中离子进入质膜内，造成质膜破损，对精液中的抗氧化酶的作用降低。三七皂甙R1对增强精液清除自由基的能力，提高精子抗氧化酶（如：SOD、GSH-Px等）有促进作用，但各试验组精液中MDA的浓度差异不显著，且保存第5d时，添加三七皂甙R1对降低精液中MDA浓度无效果，可能由于三七皂甙R1消除自由基能力有限，使得三七皂甙R1增强精液中T-AOC浓度的作用有限，因而使其消除氧化产物MDA作用不显著。4.4小结在自配“稀释液3”中加入15μmol/L时的SchB时，提高精子活率、质膜完整性、顶体完整率、T-AOC浓度、降低MDA浓度都有明显作用，为SchB在常温精液中的应用奠定基础。在自配“稀释液3”添加5mmol/L的三七皂甙R1，对保护精子质膜完整率、顶体完整率、提高T-AOC浓度作用显著，但对于提高精子活率，降低精液中MDA浓度作用不显著，需进一步研究分析其结果。 38不同精子质膜保护剂对猪精液常温保存效果的影响结论本试验对自配稀释粉进行筛选、优化，得出以下结论：1.自配“稀释液3”保存效果最好，其有效保存时间为4.4d，第4天的精子活率为0.61，质膜完整率是57.32%，顶体完整率是78.12%。2.自配“稀释液3”中分别添加5mmol/L的Tau或者4mmol/L的Gln可显著提高精液常温保存活率、顶体完整率、质膜完整率、抗氧化能力。3.自配“稀释液3”中添加15μmol/L的SchB时，对提高精子活率、质膜完整性、顶体完整率、T-AOC浓度、降低MDA浓度都有明显作用。添加5mmol/L的三七皂甙R1，可显著增加精子质膜完整性、顶体完整率、T-AOC浓度，可明显降低精液中MDA浓度，但保存前期对精子活率影响不显著。进一步研究内容1．研究保存效果最佳稀的释液配方“稀释液3”的人工授精效果，统计受胎率、窝产仔数、产活仔数等指标。2．研究添加5mmol/L的牛磺酸、4mmol/L的L-谷氨酰胺、15μmol/L的五味子乙素、5mmol/L的三七皂甙R1，对猪人工授精效果，统计受胎率、窝产仔数、产活仔数等指标。3．探索联合添加两种或两种以上精子保护剂对猪精液常温保存效果的影响，优化配方。 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致谢45致谢时光荏苒，如白驹过隙，两年的研究生生活已至谢幕之时，回首往日时光，心中百感交集。此时此刻心情异常激动，此情此景心中充满感恩。衷心感谢我的导师胡建宏教授对我的谆谆教诲，您不仅是我研究生时的导师，您在生活学习上对我孜孜不倦的教诲使我逐渐成长、成熟。胡老师渊博的专业知识、严谨的治学态度、精益求精的工作作风、诲人不倦的高尚师德、朴实无华的人格魅力对我影响深远。对胡老师的培养之恩，学生无以回报，只有在以后的人生道路上努力拼搏，锐意进取。在此，向我的导师胡建宏教授表达深切的谢意与祝福！衷心感谢师母张飞老师在我大学这几年中的关心、鼓励和帮助，师母与人为善，勤俭持家的品德是我永远的榜样！感谢河南省诸美正阳种猪场、陕西省大荔县种公猪站给我提供了试验场所。河南省诸美集团的彭峰总经理在试验过程中给予我很大的帮助；陕西省大荔县种公猪站的马云会场长在专业技能上、工作生活态度上给予我很大的启发都在试验、生活中给我很大的帮助，没有他们的帮助，我无法顺利完成试验,在此对他们表示诚挚的感谢!衷心感谢苏泽智、何锦、朱林炜、慕勇、王艳华、朱庆超、张小刚等研究生及师兄闫冠杰、师弟谢东淇、卫帅毅等师弟在我试验过程中给予的建议和帮助！衷心感谢我的同学段晓红、田春丽、陈慧琳、曹志昂等在我研究生期间生活和学习上的鼓励和帮助！衷心感谢我的家人的关心与无私奉献，家人在经济及精神上的支持与鼓励将使我终生难忘，在此深表感谢！衷心感谢我的同学，朋友给予我学习生活上的帮助以及在我遇到挫折时给予我精神上的鼓励和安慰！衷心感谢在我大学期间动物科技学院的各位领导和老师对我的学习和生活的帮助和支持！衷心感谢所有帮助和关心我的老师，亲人和朋友。谨祝以上所有人：身体健康，阖家幸福，好人一生平安。刘琦2015年5月12日 46不同精子质膜保护剂对猪精液常温保存效果的影响作者简介刘琦，女，汉族，1990年7月出生，新疆石河子人，共青团员。2013年7月毕业于东北林业大学野生动物资源学院动物医学专业，获农学学士学位。2013年9月就读于西北农林科技大学动物科技学院养殖专业硕士研究生，研究方向为动物生殖生理调控。研究生期间发表论文：刘琦，苏泽智，王乐，冉舒文，胡亚美，曹诗瑜，李思慧，杨公社，胡建宏.谷胱甘肽对猪精液常温保存效果的影响，畜牧与兽医（已接收）
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