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东北农业大学硕士学位论文不同抗氧化剂对猪精液常温保存的影响姓名：孙琪申请学位级别：硕士专业：发育生物学指导教师：周佳勃20090620 摘要摘要随着家畜人工授精技术的广泛应用,精液保存技术越来越受重视。猪精液冷冻保存技术操作程序繁杂,技术要求较高,解冻后精子存活率低,而且人工授精受胎率过低。从液态保存效果来看,常温保存更有利于猪的繁殖,能产生更大的经济效益。本实验在常温条件下，通过向猪精液中分别添加不同浓度的抗氧化剂或更换稀释液的方法，从活力、活率、顶体完整率、质膜完整率、DNA损伤率、体外受精卵裂率及囊胚率等方面，评价保存10天过程中猪精液质量。取得如下结果：1.向稀释液中添加1mM，5mMGSH均能显著提高精子保存质量。其中添加1mM效果最好。2.向稀释液中添加2mM，4mM半胱氨酸均能提高精子保存质量。其中2mM效果最好。3.稀释剂中添加0.2mM丁羟甲苯，能显著提高精子保存质量。4.更换稀释剂的方法使得精子在前五天各项指标维持良好状态，五天后精子各项指标显著下降。关键词：猪，常温保存；GSH；半胱氨酸；丁羟甲苯Ⅰ AbstractEffectofDifferentAntoxidantsonBoarSemenPreservationatAmbientTemperatureAbstractWiththeextensiveuseofartificialinseminationinlivestocktechnology,semenpreservationtechniquebecomesmoreandmoreimportant.Boarsemencryopreservationtechnicalproceduresarecomplicated,needahightechnicalrequirements,butthepost-thawspermsurvivalrateisverylow,whichleadstothelowrateofartificialinsemination.Fromtheeffectofboarpreservationinliquid,theambienttemperatureismoreconducivetotheboarbreeding,italsoproducesgreatereconomicbenefits.Thisexperimentexaminedthequalityofboarsemensupplementedwithdifferentconcentrationsofseveralantioxidantsorreplacedtheextenderatambienttemperatureconditions.Fromthemotility,viability,acrosomeintegritypercentage,tailcoilingpercentage,DNAdamagepercentage,andcleavagerateandblastocystrateofinvitrofertilization,weevaluatedsemenqualityofboarduring.10days.Achievedthefollowingresults:1.Supplementedwith1mM,5mMGSHareallabletoimprovethequalityofspermpreservation.Supplementedwith1mMGSHgotthebesteffect.2.Supplementedwith2mM,4mMcysteinecanimprovethequalityofspermpreservation.Supplementedwith2mMgotthebesteffect.3.Supplementedwith0.2mMBHTcansignificantlyimprovethequalityofspermpreservation.4.Thereplacementofextendermakethespermqualityofthefirstfivedayshasnosignificantdifferences,fromthefifthdaythereisasignificantdropinspermquality.Keywords:boar;ambienttemperaturepreservation;GSH;cysteine;BHTCandidate：SunQiSpeciality：DevelopmentBiologyScienceSupervisor：AssociateProf.ZhouJiaboⅢ 研究生学位论文独创声明和使用授权书独创声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得（注：如没有其他需要特别声明的，本栏可空）或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。（保密的学位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签名：日期：年月日导师签名：日期：年月日 前言1前言随着家畜人工授精技术的广泛应用,精液保存技术越来越受重视。使用冷冻精液可以不受地域和时间的限制,并且能长时间的保存优良公畜的遗传资源。但猪精液冷冻保存技术操作程序繁杂,技术要求较高,解冻后精子存活率低,而且人工授精受胎率过低,猪的精液冷冻保存效果不甚理想。目前猪的冻精解冻后只有30%左右的活率（AbeydeeraLR,DayBN，1997）。使用猪冷冻精液进行人工授精效果远不如鲜精授精及自然交配（高飞等，2004）。因此,猪的人工授精精液主要使用液态保存,用相对较低的精子剂量获得较高的授精率,从而提高遗传资源利用率（蒋如明，2005）。从液态保存效果来看,常温保存更有利于猪的繁殖,能产生更大的经济效益（晓春，2001）。1.1精液常温保存精液保存会伴随精子活力以及受精能力的降低（YoshidaM，2000）。在15℃以上保存猪精液已经在英国和其他欧洲国家取得商业成功（Melrose,D.R.，1972）。PurselVG(1979)则认为15℃以上的贮存温度能够较好地保存精子的受精能力。进行猪精液室温保存的关键是稀释液，稀释液中含有缓冲液和营养物质，可以在采精后的一段时间内保持精子活力（KusterCE,AlthouseGC，1999）。早期猪精子稀释液由Milovanov在1931–1933提出（Milovanov,1962）。Plisko(1965)首先发明了含有EDTA的稀释液。chyr等人(1980)证明，用这种稀释液保存4天的精子活力在50%以上，妊娠率69.8%，窝产仔数8.4个。Gottari等(1950)研制出了名为Zoriesco的长寿稀释液(Gottari，1980)。1975年Purse和Johnson发明了被广泛应用的Beltsville-TS（BTS）（Johnsonetal.,1988）。据1976年资料统计(康文彪,1992),广西、广东、上海、江苏、山东、陕西、北京等地有近百万头母猪接受了常温保存精液人工授精,受胎率达到了80%。1.2抗氧化剂从实际角度出发，精液在保存期是无法避免受精能力降低的，即使使用所谓的“长期”稀释液。精子呼吸代谢能产生活性氧族(ROS),携带有氧自由基,造成过氧化损伤,这是受精能力下降的重要原因。因此添加抵抗自由基的成分是十分必要的(高飞等，2004)。但是由于物种和抗氧化剂作用机理的不同,抗氧化剂在精液冷冻保存中的添加量和作用效果不尽相同。根据抗氧化剂化学本质和作用机理的不同可以分为维生素、酶类等几种。1.2.1谷胱甘肽谷胱甘肽属于非蛋白类巯基化合物，在哺乳动物细胞中发挥着重要的生物学活性作用（PastoreAetal.,2003）。这种化合物在细胞外源性和内源性化合物的解毒和抗氧化作用、细胞增殖、氨基酸转运、蛋白质和DNA合成、二硫化物及其它化学中起着重要的作用，同时还维持着细胞内氧化还原反应的正常进行（MaherP,2005），是机体内最主要的非蛋白巯基化合物。精子质膜含有大量的不饱和脂肪酸，从而为精卵结合提供必要的条件。ROS可以导致精子细胞质膜的脂质过氧化，质膜不可逆地丧失流动性，造成精子质膜损伤（StoreyBT,1997;PottsRJetal.,2000），因而造成细胞内酶缺失，并引起DNA损伤（Aitken1 东北农业大学理学硕士学位论文RJ,1999;LuberdaZ,2001）。精液中存在消除自由基的系统，由酶和非酶两类组成，非酶系统的主要代表就是谷胱甘肽（LewisSEetal.,1997）。GSH广泛分布于活细胞中，它可与ROS发生反应，并作为谷胱甘肽过氧化物酶的辅助因子催化减少过氧化氢（BilodeauJ-Fetal.,2001）。大量证据表明，精子中存在GSH，但其浓度因物种不同而存在差异。如在小鼠精8子中可以发现相对较高的GSH水平，达到90nmol/10个精子（AlvarezJG,etal.,1989）。猪和99兔精子中GSH的含量非常低，分别为0.3nmol/10个精子及0.1nmol/10个精子（LiTK,1975）。精液中也存在GSH，有证据显示，猪的精液中存在较高水平的GSH（StrzezekJetal.,1999;StrzezekJ.2002）。1.2.2半胱氨酸半胱氨酸是细胞内谷胱甘肽生物合成的前体物质（MeisterA,TateSS1976）。巯基乙胺、β－巯基乙醇、半胱氨酸、胱氨酸等含硫氨基酸等一些不同种类低分子量的硫醇类物质，可诱导卵母细胞中GSH的合成（LuberdaZ,2005）。在补充半胱氨酸或半胱胺的培养液中，卵丘细胞还能够促进卵母细胞对半胱氨酸或半胱胺的吸收，使卵母细胞从培养液中获得充足的GSH合成底物（deMatosDGetal.,1997）。BilodeauJF等（2001）证明像半胱氨酸之类的巯醇物质，可以保护冷冻-解冻后的牛精子活力免受过氧化氢的伤害。H.Funahashia,和T.Sano（2005）证明，10℃下添加半胱氨酸可以提高猪精子的活力、顶替完整性和体外穿透性。1.2.3丁羟甲苯丁羟基甲苯(butylatedhydroxytoluene,BHT)是一种合成的脂溶性酚类抗氧化剂,是一种广泛使用的食品添加剂。近年来,人们发现在动物液态精液中添加BHT可以有效保护精子的质膜完整性,降低冷休克对牛、羊及猪精子的损伤。BambaandCran发现BHT可以延长精液的保存时间（1992）。但是保存精液中添加BHT的结果也是不尽相同的。尽管BHT改善了牛精液和冷冻的火鸡精液(DonoghueandDonoghue,1997)的冷应激(GrahamandHammerstedt,1992)和冷冻保存(Killianetal,1989)，但却会损害冷冻的马精子(Balletal,2001)。Roca等（2004）证明，在冷冻稀释剂中添加1.6mM的BHT对猪精液无益。同样，BambaandCran(1992)发现当BHT浓度高于2mM时会失去对精子冷应激的保护作用。1.3精子质量检测目前，猪人工受精技术已经逐步得到广泛应用。然而，输精后尤其是用冷冻的精液的受胎率却很低，这与精子的受精能力的关系是很大的（Johnsonetal.2000）。受精是一个很复杂的过程，对精子的要求很高。精子作为一种复杂的终端细胞，要想圆满地完成受精任务，必须具备一定的条件。例如，存活超激活状态的获得、顶体完整、具有获能能力、DNA结构正常以及能与雌性生殖道作用、与卵子透明带结合、穿卵等(LindsayGillanetal.2005)。因此，在人工受精前对精子进行质量评估，以预言其受精能力是很必要的。1.3.1精子活力精子活力(spermmotility)是保证精子通过雌性生殖道并与卵子相遇、穿透卵膜的重要条件，测定的是直线运动精子数占精子总数的比率。因为可以在普通光学显微镜下直接观察2 前言计数精子活力，所以这不可避免地带有一定人为误差。尽管精子活力检测有些限制，但猪精子活力与母猪分娩率和产仔率显著相关(GadeaJetal.2004;SellesEetal.2003)，人的精子活力与穿卵试验结果的相关系数为0.72，P<0.01(刘金荣和路华,1992)，羊的精子活力与穿卵试验结果的相关系数为0.76-0.90，P<0.01(SuttigotinCJetal.1995)。所以精子活力是检测精液质量的一个有效指标，并因为其简单、快捷、廉价，是应用最为广泛的方法，是检测精子质量很好的指标。计算机辅助系统精子分析仪(CASA)的应用，不仅提高了检查结果的客观性，而且提供了许多传统精液分析所不能提供的参数，并且发现与繁殖力显著相关(HiraiMetal.2001)。但是CASA分析系统受诸多因素影响，如精子浓度的准确性，容易受到精液中细胞成份和非细胞颗粒值的干扰，测定值往往偏高。所以，CASA也不能免除其它技术和人为误差(VerstegenJetal.2001)。1.3.2精子活率精子活率(spermviallility)是指活精子数占总精子数的比率。是一项常规的精液检验（ShipleyCF，1999）。以前人们在应用中把在显微镜下直接观察到的活动的精子当作活精子，它的数值与精子总数比值作为精子的存活率。这种方法由于精子受到温度和稀释液的影响，精子的运动状态不同，所以现在此方法极少使用。目前常规染色方法如伊红染色、伊红一苯胺黑染色、姬姆萨染色等(林海萍等，2000)，已广泛应用于动物精子活率的检测中。姬姆萨染色可以着色死精子，以此来计算精子活率。但是在常规染色过程中，精子容易受到损伤而死亡，使精子活率低于实际情况。随着染色技术的发展，活体荧光染色技术在精子质量检查上得到应用。活体荧光染料对细胞损害很小，因此用该法得到的活率结果是比较准确的。死精子特异性荧光探针有碘化丙锭(PI)、澳化乙锭(EB)、澳乙咤二聚体(EH)和Hoechst33258等；活精子特异性荧光探针有羧基荧光素双醋酸盐(CFDA)、羧基二甲基荧光素双醋酸盐(CDMFDA)、钙黄绿素乙酰基甲基酯(CAM)、Hoechst33342等(ThomasCAetal.,1997)。1.3.3精子顶体状态在精子细胞核的前端大约2/3的部分，覆盖着帽状囊泡样的顶体，顶体为一个囊泡状的结构，位于质膜和核膜之间，其中含有与穿卵有关的多种水解酶类。顶体反应是受精过程中重要的一步。发生在活精子中的顶体反应称为真顶体反应(TAR)，这种精子获得了穿透卵子透明带并与卵质膜融合的能力。而当精子死亡时可能失去顶体，这称为假顶体反应(FAR)。顶体反应时，顶体释放出酶，消化卵丘细胞基质，溶解透明带使精子通过质膜，完成受精过程。只有顶体完整的和顶体反应能适时发生的精子才能受精。如果精子的顶体肿胀或脱落，顶体中的酶类丢失，上述的受精过程就不能进行。考马斯亮蓝（Coomassiebrilliantblue）染色是用来评价精子顶体完整性的一种简单方法，直接染色后就可在光学显微镜下观察(Zou,Yang,2000)。目前，利用免疫荧光技术，即用异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate,FITC）标记的免疫结合物更能准确地检测精子顶体状态。常用的免疫结合物有两类：一类是能深入死精子顶体内与抗原特异结合的CTC；一类是非渗透性的、能与活精子顶体相连物特异结合的植物凝集素。常用的植物凝集素有豌豆凝集素（Pisumsativumagglutinin，PSA）、花生凝集素（Arachishypogaeaagglutinin，PNA）、伴刀豆素（Concanavaliaensiformisagglutimin,Con-A），另外还有WGA、RCA-、UEA、LysoTrackerTMGreenDND-26等(LindsayGillanetal.,2005)。尤其是前两种已得到广泛的应用(CrossandStanleyMeize,1989)。3 东北农业大学理学硕士学位论文1.3.4精子质膜完整性精子质膜对于维持自身新陈代谢、经历获能、顶体反应（AR）、粘符和穿透卵母细胞透明带至关重要（BurksandSailing，1992），而质膜又是精子在冷冻解冻过程中最易受到破坏的位点（Jeyendran，1984）。研究发现，冷冻保存往往造成精子一些获能样变化(Cormier,etal.,1997)，而质膜的损伤和变化又会导致其存活力和受精力下降。精子凋亡早期与其他细胞一样，质膜磷脂酰丝氨酸（PS）外翻，同时出现染色质凝集和边缘化特征，但仍可保持其通透性。而死精子则完全丧失膜的通透性。所以目前认为精子质膜完整性是其死活的一个间接指标。早在1966年，Drevius和Eriksson曾描述过哺乳动物精子弯尾现象（tailcoiling）（Drevius,1966）。以后，一些研究表明低渗肿胀实验（HOST）有助于预测精子对卵子的受精能力（CorreaJR,ZavosPM,1994），虽然在研究中不同精子参数相关性有差异。肿胀弯尾率与精子获能率、穿卵率和精子活力显著相关。在不同低渗液和不同渗透压下研究表明，猪精子在以柠檬酸与果糖为低渗液（渗透压为150mosm/L,37℃）时尾部肿胀最明显（Vazquezetal,1997）。1.3.5中性彗星电泳完整的精子DNA是繁殖优良后代的必要条件，精子在成熟过程中经历了鱼精蛋白取代组蛋白的染色体包装过程，这导致DNA-鱼精蛋白复合体高度致密（Roriguez-Martinezetal.2+1990）。猪精子DNA稳定性受锌离子(Zn)影响，它会结合自由巯基在鱼精蛋白之间形成二硫桥结构(Strze_zekandKordan2003)。精子中高水平的DNA损伤伴随着低受精率，或者与早期胚胎死亡有关(AgarwalandSaid2005)。彗星电泳又被称为单细胞凝胶电泳(SCGE),是一种检测单个哺乳动物细胞DNA损伤的技术（RossGMetal.1995），起源于1978年Rydberg和Johanson报道的无电泳的单细胞凝胶分析（CollinsARetal.1995）。Ostling（1984）以变性剂和高浓度盐使细胞溶解,然后在中性条件下电泳，1988年此技术被进一步发展为在碱性条件下（McCarthyPJetal.2005）。中性彗星电泳能检测单个细胞DNA链断裂，所以被广泛应用(Singhetal.1988)。细胞经裂解及DNA解旋后,在电泳过程中,断裂的DNA碎片因携带负电荷而向正极移动,未断裂的DNA在原位不动,经溴化乙锭染色后,核在原位形成一个明亮的头部，DNA碎片形成尾部,似彗星状,DNA损伤越严重,碎片越多,尾部DNA越多,尾部长度越长。因此,测量彗星尾部形状或荧光强度就可知DNA损伤的程度。Duty等（2002）和Linfor及Meyers(2002)分别用彗星电泳检测了冻存的人类和马的精子。FraserandStrzezek(2004)用此法检测液态保存猪精液的DNA完整性。1.3.6体外受精体外受精是指在体外环境完成精卵结合的过程，包括卵母细胞体外成熟、精子体外获能、卵母细胞体外受精、受精卵体外发育等程序(郭志勤等，1998)。在1954年，Thibault和Dauzier等，用从母兔子宫中回收的精子，使兔体外受精成功，但知道1959年Chang才使兔体外受精产仔。Dauzier和Thibault（1959）使绵羊卵母细胞体外受精后，见到了原核。1985年花田章使绵羊体外受精产羔成功。关于猪的体外受精，先是在1975年有Iritani等使体外受精卵发育到卵裂。Cheng等（1986）在英国报道了猪体外受精产仔，系用射出的新鲜精子与体内成熟排出的输卵管卵进行体外受精发育而成。1988年Nagai等（1988）报道了使用冷冻精子进行体外受精，并且获得一窝3只仔猪。将新鲜精子改成使用冷冻精子，不但在技术上向前发展，而且更利于实际应用。灵长类的体外受精有研究是由Gould等（1973）首先报道发育到乱类，后来有了更大进展。在猴、狒狒、猩猩等均有深入研究。1989年Mattioli等利用屠宰母猪卵巢分离未成熟卵母细胞，在体外做培养成熟处理，然后与射出的新鲜精子体外受精，4 前言移植8头受体，其中1头母猪产9头活仔和1头死胎。该研究买能与从繁琐处理的供体母猪用手术法采集及其有限的卵源，可从屠宰母猪卵巢获得大量卵母细胞，变废为宝，更有利于实际应用。体外受精技术是动物胚胎学、发育生物学领域的重大技术突破，具有重要的理论和实际意义。5 东北农业大学理学硕士学位论文2材料与方法2.1试验材料2.1.1实验动物试验所用精液均取自三元猪场成年、健康、采精频率正常的公猪。猪卵巢取自于哈尔滨市当地屠宰场。2.1.2主要仪器和设备（1）医用超净台：苏州净化设备有限公司产品。（2）倒置显微镜：日本NIKON公司产品。（3）培养箱：美国FORMA公司CO2培养箱。（4）普通冰箱：Haier，SC-276型。（5）电子天平：MettlerToledo，AG135型。（6）普通离心机：上海手术器械厂，80-2型。（7）荧光显微镜：德国Leica公司，DF28型。2.1.3主要试剂（1）GSH：sigma公司产品，上海博蕴生物公司分装，货号：G-6013（2）L-半胱氨酸：Sigma公司产品，上海博蕴生物公司分装，货号：G-6251（3）丁羟甲苯：Sigma公司产品，上海博蕴生物公司分装，货号:B-3903（4）β-巯基乙醇：Sigma公司产品，上海博蕴生物公司分装，货号：M-7522（5）蛋白酶K:Sigma公司产品，上海博蕴生物公司分装，货号:P-2O49(6)RNA酶A：Sigma公司产品，上海博蕴生物公司分装，货号:R-4385（7）BSA：Sigma公司产品，货号：A3311-50G（8）TritonX-100：Sigma公司产品，货号：K-0092（9）透明质酸酶：Sigma公司产品，货号：H-42722.1.4液体配置CTC缓冲液：Tris1.21g/500ml;NaCl3.7986g,用HCl调节pH值到7.8。CTC染液：CTC0.0019g;Cystein（半胱氨酸）0.0033g;CTC缓冲液5ml。注：此染液现用现配使用，避光保存。12.5%的多聚甲醛液：Tris6.05g/100ml(用盐酸调到PH值=7.4)；多聚甲醛12.5g/100ml。3%的PVP溶液：PVP聚乙烯吡咯烷酮(40,000)3g；PBS100ml。Hoechst33258溶液：Hoechst332580.001g；PBS液10ml。增光剂：甘油:PBS(9:1)10ml;1,4-diazabicyclo[2,2,2]octane(三乙烯二胺)0.2468g。.低渗液：7.35克柠檬酸钠2H2O,13.51克果糖，溶于1000ml三蒸水。裂解液：2.5mol/lNaCl,100mM/lEDTA,10mM/lTris-base,pH10,1%十二烷基肌氨6 材料与方法钠,1%TritonX-100。RNA酶处理液：2.5molNaCl,5mMTris,0.05%十二烷基肌氨酸钠,pH7.4，20ug/cm3RNase-A。中性电泳液：300mM/l醋酸钠,100mM/lTris,pH9。PVA-TL-HEPES:见附表1成熟培养液(MaturationMedium):见附表2胚胎培养液(pZM-3，PigZygotesMedia-3):见附表3操作液(oocytemanipulationmedium):见附表4稀释液：见附表5孵育液：见附表62.2试验方法2.2.1精液品质的检查2.2.1.1外观上检查选择正常精液的颜色为乳白色，浓稠精液略带黄色,略带腥味而无其它异味。精液量，一般浓厚部精液量为150-200ml左右。2.2.1.2活力的测定取50μl精液用1ml孵育液稀释，在37℃下孵育20min。然后取20μl滴在有热台加热到37℃的血球计数板上，盖上盖玻片，在40倍相差显微镜下观察，计算精子活力（直线运动精子）。精子活力=（直线运动精子数/精子总数）×100%2.2.1.3精子活率和顶体变化测定用活体荧光染料Hoechst33258-CTC联合染色。从各实验组的精液中，取出50μl用1ml孵育液稀释后在37℃下孵育20min。（1）取396μl精子悬浮液，加入4μlHoechst33258染色液。混匀，避光室温保存3min，制成精子孵育液。（2）l.5ml离心管中放入1ml3%的PVP溶液，然后将精子孵育液轻轻铺在PVP溶液上500g离心6min，沉淀去上清。（3）精子沉淀用50μlmPBS液悬浮吹打均匀。（4）取45μl精子悬液加入45μl的CTC染液，混匀。然后在加入8μl12.5%的多聚甲醛溶液混匀。（5）取干净的载片，加入10μl精子悬液，再加入等量的增光剂，混匀后盖上盖片。（6）垫上吸水纸用力压片排除气体及多余液体。（7）用无色指甲油封片，并避光保存。封片后要尽快观察。（8）死活检查：Hoechst33258能着色死精子（着色DNA）并在波长330-380nm辐射波长420的紫外光激发下使死精子头部发兰绿荧光光。活精子核区不着色不发光。在荧光显微镜200倍下计算未着色精子数。（9）顶体完整性检查：使用CTC(金霉素)染色方法（Wangetal,1995）。CTC荧光染料能着7 东北农业大学理学硕士学位论文色精子顶体，在激发波长400-440nm，辐射波长470nm的紫外光下使精子的顶体发出黄绿光，在荧光显微镜400倍油镜下观察精子顶体形态，顶体完整的精子整个头部都有黄色荧光。每次检测时要用细胞计数器数200个精子。精子活率=（未着色精子数/精子总数）×100%顶体完整率=（顶体完整精子数/精子总数）×100%2.2.1.4对精子质膜的完整性检查使用低渗肿胀法。在各实验组的精液振荡混匀取出50μl,放入37℃1ml低渗液中，混匀，30min后取出20μl滴在干净的血球计数板上，40倍相差显微镜下观察5个视野，计算弯尾精子的百分率。每次检测时要用细胞计数器至少数200个精子。弯尾率=（弯尾精子数/精子总数）×100%先将小瓶中精液振荡混匀,然后再从小瓶中吸取50μl的精液,检测精子活率、活力弯尾率及顶体完整率。每天检查一次，共计10天。2.2.2彗星电泳法检测DNA断裂(1)在毛玻璃片上涂一层标准熔点琼脂糖。(2)将10μl精子与75μl的0.50%的低熔点琼脂糖混合，覆盖在毛玻璃片上，盖上盖玻片。(3)凝固后轻轻移开盖玻片，再涂上一层75μl的0.50%的低熔点琼脂糖，凝固后移走盖玻片(4)把载玻片浸入冷的裂解液中，4℃放置2h。(5)RNA酶处理4h。3(6)蛋白酶K消化37℃过夜，同样的缓冲液中添加1mg/cm蛋白酶K。(7)液体排干后，载玻片置于水平电泳仪中，在中性电泳液中平衡20min。(8)2V100mA室温电泳一小时。(9)电泳结束后，将盖玻片置于70%酒精中15分钟，取出风干，EB染色。(10)荧光显微镜下观察，计算拖尾率即DNA损伤率。2.2.3体外受精体外受精(invitrofertillzation，IVF)是指在体外环境完成精卵结合的过程，主要包括精子的体外获能、卵母细胞的体外成熟培养、卵母细胞的体外受精和受精卵早期培养等几个连续的过程。2.2.3.1卵母细胞的准备第一天上午:准备成熟培养滴:称取0.0070gcysteine溶于5.0mlMaturationMedium中;取其中0.5ml加于9.5rnlMaturationMedium中；分别加入10µlFSH、LH、EGF和lmlFCS；混匀后从中吸走lml混合液，后加入lml卵泡液;混匀后用0.22nm滤器过滤；四孔板中每孔加入该液体500µl，覆盖石蜡油；部分剩余液体做成200µl的小滴于直径3.5cm小平皿中并覆盖石蜡油即为洗滴；将四孔板和小平皿置于38.5℃、5%CO2、95%CO2的培养箱中平衡待用。下午:(l)取卵巢：下午4:00左右从屠宰场取回新鲜卵巢，置于38.5℃加双抗的生理盐水中，lh内运回实验室。8 材料与方法(2)抽卵：用38.5℃加双抗的生理盐水清洗卵巢；用10ml针头直径1.2mm注射器抽取卵巢表面直径3-5mm卵泡的原因是：更大卵泡的闭锁比例可能更高，更小卵泡的发育程度可能低。收集卵泡液于50ml离心管中。(3)捡卵：TL-HEPES清洗卵泡液两遍；清洗后液体倒入大平皿中；实体镜下用直径200µm左右的口吸管/手吸管捡取胞质均匀、表面覆盖3层或以上颗粒细胞的卵丘-卵母细胞复合体(COCs)；(4)培养：将捡出的COCs在小平皿中的洗滴中清洗3遍；之后转入四孔板中，每孔50~70枚；置于38.5℃、55%CO2、95%O2的培养箱培养42~44h。第三天：:上午：(l)准备胚胎培养液(PZM-3)：在PZM-3加入20ml/L比必需氨基酸和10ml/L非必需氨基酸。(2)取一支装有1ml、0.5%的透明质酸酶置于38.5℃恒温培养箱中预热待用。下午：(l)消化COCs：将培养42~44h后的COCs转入装有透明质酸酶的离心管中，置于旋涡震荡器上震荡3.5min以脱去卵丘细胞。(2)挑选成熟卵母细胞：将(l)处理后的透明质酸酶转入装有操作液的小平皿中；用口吸管/手吸管，挑选成熟的卵母细胞，以排出第一极体作为成熟的标志。(3)将以挑选成熟的卵母细胞转入受精滴(mTBM)中，洗涤三次，转入50µl受精滴中，每滴大约20~30枚卵母细胞。2.2.3.2精子的准备离心(3000rpm，5min)，弃去上清，加入lmlDPBS悬浮；重复离心，弃上清，加入lml的mTBM重新悬浮，待用。2.2.3.3体外受精过程取出成熟培养42~44h的卵母细胞，去卵丘细胞。挑选胞质饱满均匀，有极体的卵母细胞移入到预平衡过的mTBM中洗3~5次。然后移入到50µl受精滴中，加入50µl精液，在39℃、5%CO2培养箱中共同孵育6h。2.2.3.4体外培养将共孵育6h的卵母细胞在胚胎培养滴(PZM-3)中洗涤3-5次，移入平衡过的500µl胚胎培养滴中培养。24~48h检查卵裂率，6~7d检查囊胚率。2.2.4更换稀释液每天在固定时间移去稀释液，并加入等量新鲜的稀释液。2.3统计分析用SPSS13.0软件对数据进行统计分析，数据经过LSD转变后用ANOVA模块进行分析，P<0.05认为差异显著，所有实验均至少重复3次。9 东北农业大学理学硕士学位论文3结果3.1稀释液中添加不同浓度谷胱甘肽3.1.1添加不同浓度谷胱甘肽对精子活力的影响表3-1添加不同浓度谷胱甘肽对精子活力的影响Table3-1EffectsofsupplementedwithdifferentconcentrationsGSHonspermmotility天数DaysGSH01234567891091.286.884.480.575.269.662.555.843.635.327.60mM±2.7±4.5±5.3±4.2±2.4±7.3±5.7±1.6±5.3±1.1±7.791.288.887.586.284.381.175.670.264.558.749.81mMa±2.7±2.8±7.0±3.7±1.7±6.7±5.2±5.8±7.6±2.4±1.1aaaaaaaa91.288.486.786.482.280.272.568.763.555.344.95mMa±2.7±6.6±6.8±6.2±7.6±4.5±±6.3±1.2±±aaa1.8baa3.4b4.2b91.287.284.680.477.373.566.857.250.343.531.810mM±2.7±1.9±5.3±7.1±5.5±3.7±3.4±7.7±4.3±5.3±4.9bcbcc（相同符号之间差异不显著，p>0.05）由表3-1可知，向稀释液中分别添加1mM，5mM，10mMGSH均能提高精子活力。其中添加1mMGSH效果最好。10mM效果相对较差，但结果仍显著高于对照组。3.1.2稀释液中添加不同浓度谷胱甘肽对精子活率的影响表3-2添加不同浓度谷胱甘肽对精子活率的影响Table3-2EffectsofsupplementedwithdifferentconcentrationsGSHonspermviability天数DaysGSH01234567891095.591.791.586.383.678.276.572.768.462.953.70mM±2.7±3.2±7.4±7.5±1.9±5.4±6.6±6.2±7.1±4.6±2.4b95.592.191.787.385.284.480.777.774.269.763.41mM±2.7±4.5±6.4±1.2±7.8±5.8±1.7±4.3±4.3±7.5±5.4aaaaaa95.593.092.288.184.683.778.576.370.264.758.55mM±2.7±3.1±6.3±3.2±6.5±7.3±7.5±6.7±5.3±4.3±3.9aabab95.591.590.888.084.180.177.373.069.763.556.210mM±2.7±5.6±5.4±6.7±4.4±4.2±4.4±5.4±2.1±5.6±2.7abb（相同符号之间差异不显著，p>0.05）由表3-2可知，向稀释液中添加1mM，5mM，10mMGSH均能提高精子活率。其中添加1mMGSH效果最好，显著高于其他组结果。10mM效果相对较差。10 结果3.1.3释液中添加不同浓度谷胱甘肽精子对顶体完整率的影响表3-3添加不同浓度谷胱甘肽对精子顶体完整率的影响Table3-3EffectsofsupplementedwithdifferentconcentrationsGSHonpercentagesofacrosome-integratedsperm天数DaysGSH01234567891097.396.794.590.387.683.580.477.369.863.554.70mM±±±±±±±±±±±2.73.45.57.36.35.5a4.34.3a6.1a7.26.497.397.196.392.590.387.684.582.177.872.366.61mM±±±±±±±±±±±2.75.56.23.44.27.25.3a9.2b7.33.4a6.7a97.396.796.192.090.186.581.380.376.570.364.45mM±±±±±±±±±±±2.76.24.27.57.41.55.45.3ab6.44.5ab7.3a97.395.895.491.688.986.580.578.373.267.860.110mM±±±±±±±±±±±2.77.31.95.36.16.38.21.5ab5.2b6.3b1.5b（相同符号之间差异不显著，p>0.05）由表3-3可知，添加GSH保存10天后顶体完整率仍维持在60%以上，顶替完整率下降趋势并未像活力下降一样明显。其中添加1mM效果最好，与添加5mM，10mM组别差异不显著。3.1.4释液中添加不同浓度谷胱甘肽对精子弯尾率的影响表3-4添加不同浓度谷胱甘肽对精子弯尾率的影响Table3-4EffectsofsupplementedwithdifferentconcentrationsGSHonpercentagesofspermtailcoiling天数DaysGSH01234567891094.692.585.783.680.378.474.365.759.554.243.10mM±±±±±±±±±±±2.75.27.33.27.64.5b4.36.46.36.77.394.692.891.789.286.582.380.775.966.162.355.21mM±±±±±±±±±±±2.74.46.4a6.4a6.4a6.4a7.4a1.9a6.3a2.9a5.4a94.691.990.289.286.781.379.573.265.759.451.15mM±±±±±±±±±±±2.71.82.3a9.0a1.3a5.3a4.6a6.3a5.3a5.4b2.5b94.691.587.185.481.279.674.466.160.255.546.710mM±±±±±±±±±±±2.77.45.15.43.06.2ab5.23.47.23.16.4c（相同符号之间差异不显著，p>0.05）由表3-4可知，添加1mM，5mMGSH均能显著提高精子弯尾率，保存8天后仍能维持60%，二者差异不显著，但1mM效果更好。添加10mMGSH结果略好于对照组，但差异不显著。11 东北农业大学理学硕士学位论文3.1.5释液中添加不同浓度谷胱甘肽对精子DNA损伤率的影响表3-5添加不同浓度谷胱甘肽对精子DNA损伤率的影响Table3-5EffectsofsupplementedwithdifferentconcentrationsGSHonpercentagesofspermDNAdamage天数DaysGSH0123456789108.211.413.517.419.825.628.836.742.550.259.30mM±±±±±±±±±±±3.74.56.53.85.78.4b3.55.4a6.24.74.68.29.912.416.317.921.323.433.538.445.553.71mM±±±±±±±±±±±3.72.35.66.32.18.4a5.7a3.4b5.9b3.8b7.0b8.29.411.615.917.419.722.628.735.141.248.35mM±±±±±±±±±±±3.77.82.56.78.42.3a4.2a1.90.9a5.3a7.2a8.210.613.517.018.422.526.734.541.247.358.710mM±±±±±±±±±±±3.74.62.47.36.67.1ab3.45.7ab8.56.3b2.8（相同符号之间差异不显著，p>0.05）由表3-5可知，添加1mM，5mMGSH均能显著降低精子DNA损伤率，二者差异在前六天不显著，其中1mM效果略好。添加10mMGSH则与对照组无显著差异。3.1.6稀释液中添加不同浓度谷胱甘肽对精子体外受精卵裂率和囊胚率的影响表3-6添加不同浓度谷胱甘肽对精子体外受精卵裂率和囊胚率的影响Table3-6EffectsofsupplementedwithdifferentconcentrationsGSHonratesofcleavageandblastocystGSH卵裂率囊胚率天数Days024681002468100mM72.270.466.455.340.328.713.412.610.27.43.10.0±4.3±2.7±5.6±4.9±6.8±7.2±5.4±6.7±2.1±6.8±±b8.90.01mM72.270.267.361.451.939.813.413.012.110.47.53.1±4.3±6.7±5.5±±±±5.4±5.4±2.3±1.6±±aaaaaa7.89.63.45.31.25mM72.271.265.257.646.730.613.412.611.010.27.02.0±4.3±3.4±7.5±±±3.4±5.4±5.4±3.5±7.2±±bbaaa5.32.14.70.810mM72.270.564.154.342.530.113.412.210.18.9±4.10.0±4.3±3.4±2.9±6.4±4.3±6.2±5.4±2.9±1.6ab±±2.53.20.0（相同符号之间差异不显著，p>0.05）由表3-6可知，各组别在前四天卵裂率和囊胚率均无显著差异。添加1mM，5mMGSH均能较好的维持精子卵裂率和囊胚率，前者效果稍好于后者。10mM与对照组无显著差异。12 结果3.2稀释液中添加不同浓度半胱氨酸3.2.1稀释液中添加不同浓度半胱氨酸对精子活力的影响表3-7添加不同浓度半胱氨酸对精子活力的影响Table3-7Effectsofsupplementedwithdifferentconcentrationscysteineonspermmotility天数Days半胱氨酸01234567891091.586.884.480.575.269.662.555.843.635.327.60mM±±±±±±±±±±±2.73.5b2.1b2.35.34.67.21.84.23.63.791.590.688.286.585.782.277.971.865.559.153.92mM±±±±±±±±±±±2.74.5a1.7a7.2a5.6a4.3a3.2a2.8a8.9a5.4a5.2a91.590.189.286.382.277.674.368.461.353.849.74mM±±±±±±±±±±±2.76.3a6.8a4.5a3.7b3.1b6.5b7.3b4.5b3.9b4.9b91.587.586.882.177.871.166.460.952.143.839.28mM±±±±±±±±±±±2.75.7ab4.3ab2.63.85.67.0c3.4c4.8c7.3c2.1c（相同符号之间差异不显著，p>0.05）由表3-7可知，稀释液中添加2mM，4mM，8mM半胱氨酸均能提高精子活力。但只有2mM，4mM组别可以维持8天60%以上的活率，其中2mM效果更好。8mM效果相对较差，但结果仍高于对照组。3.2.2稀释液中添加不同浓度半胱氨酸精子活率表3-8添加不同浓度半胱氨酸对精子活率的影响Table3-8Effectsofsupplementedwithdifferentconcentrationscysteineonspermviability天数Days半胱氨酸01234567891095.591.791.587.383.678.276.572.768.462.953.70mM±±±±±±±±±±±2.73.56.32.91.87.45.66.43.75.43.395.593.492.190.488.586.182.978.772.865.260.02mM±±±±±±±±±±±2.77.54.56.46.0a5.5a6.3a7.3a6.4a7.94.3a95.593.691.590.587.385.283.177.368.564.558.94mM±±±±±±±±±±±2.77.82.14.56.7a3.4a5.6a7.8a5.52.64.3ab95.592.290.888.284.078.276.173.569.263.456.78mM±±±±±±±±±±±2.72.21.96.45.86.75.54.96.84.53.9b（相同符号之间差异不显著，p>0.05）由表3-8可知，稀释液中添加2mM，4mM半胱氨酸均能提高精子活率。其中2mM效果最好，8mM则于对照组捂显著差异。13 东北农业大学理学硕士学位论文3.2.3释液中添加不同浓度半胱氨酸对精子顶体完整率的影响表3-9添加不同浓度半胱氨酸对精子顶体完整率的影响Table3-9Effectsofsupplementedwithdifferentconcentrationscysteineonpercentagesofacrosome-integratedsperm天数Days半胱氨酸01234567891097.396.794.590.387.683.580.477.369.863.554.70mM±±±±±±±±±±±2.73.24.65.94.32.1b7.0ab5.67.3b4.6a5.4a97.396.995.091.389.486.382.280.776.471.964.32mM±±±±±±±±±±±2.71.92.74.78.12.3a5.7a5.3a2.37.9b2.3b97.395.294.589.888.184.979.377.873.268.960.24mM±±±±±±±±±±±2.74.53.65.31.94.8ab6.8b7.24.5a6.21.697.394.593.290.788.084.381.278.071.264.456.38mM±±±±±±±±±±±2.76.32.97.69.03.5ab4.7ab7.13.6ab6.4a2.9a（相同符号之间差异不显著，p>0.05）由表3-9所知，稀释液添加2mM，4mM半胱氨酸可显著提高精子完整率，保存10天后仍可维持在60%以上的完整率，2mM效果更好，二者差异不显著。8mM也可提高顶体完整率，但与对照组无显著差异。3.2.4释液中添加不同浓度半胱氨酸对精子弯尾率的影响表3-10添加不同浓度半胱氨酸对精子弯尾率的影响Table3-10Effectsofsupplementedwithdifferentconcentrationscysteineonpercentagesofspermtailcoiling天数Days半胱氨酸01234567891094.692.585.783.680.378.474.365.759.554.243.10mM±±±±±±±±±±±2.73.55.2a7.0a2.4a4.3a5.8a4.6a3.74.5a6.394.693.490.288.584.683.180.974.666.660.253.92mM±±±±±±±±±±±2.71.92.35.64.52.37.85.43.0a2.79.3a94.693.790.587.485.082.179.673.962.458.751.14mM±±±±±±±±±±±2.75.45.16.21.83.75.24.64.8b2.72.6ab94.692.688.685.281.279.076.272.564.257.749.98mM±±±±±±±±±±±2.76.75.37.93.2a4.4a4.1a3.24.1ab2.06.5b（相同符号之间差异不显著，p>0.05）由表3-10可知，稀释液添加2mM，4mM，8mM半胱氨酸可显著提高精子弯尾率，其中2mM效果最好，8mM效果价差，但仍与对照组有显著差异。14 结果3.2.5释液中添加不同浓度半胱氨酸对精子DNA损伤率的影响表3-11添加不同浓度半胱氨酸对精子DNA损伤率的影响Table3-11EffectsofsupplementedwithdifferentconcentrationscysteineonpercentagesofspermDNAdamage天数Days半胱氨酸0123456789108.211.413.517.419.825.628.836.742.550.259.30mM±±±±±±±±±±±3.74.56.53.8a5.7a8.4a3.5a5.46.24.74.68.210.012.114.916.819.221.328.434.639.247.32mM±±±±±±±±±±±3.75.77.25.5b3.5b6.93.85.4a5.2a3.7a7.0a8.29.912.415.817.720.623.032.537.444.551.34mM±±±±±±±±±±±3.76.84.14.2ab7.3ab2.46.16.4b7.7b3.6b4.4b8.210.613.616.818.022.326.435.541.048.358.28mM±±±±±±±±±±±3.73.56.88.2ab5.7ab4.36.0a5.3c5.99.03.5（相同符号之间差异不显著，p>0.05）由表3-11可知，添加2mM，4mM半胱氨酸均能显著降低精子DNA损伤率，其中2mM效果最好。8mM效果与对照组无显著差异。3.2.6稀释液中添加不同浓度半胱氨酸精子对体外受精卵裂率和囊胚率的影响表3-12添加不同浓度半胱氨酸对精子体外受精卵裂率和囊胚率的影响Table3-12Effectsofsupplementedwithdifferentconcentrationscysteineonratesofcleavageandblastocyst半胱氨酸卵裂率囊胚率天数Days0246810024681072.270.466.455.340.328.713.412.610.27.43.10.00mM±±±±±±±±±±±±4.32.75.64.9a6.87.25.46.72.16.8a8.90.072.270.068.062.455.844.813.413.112.611.48.36.72mM±±±±±±±±±±±±aaaa4.32.75.15.45.42.95.44.96.03.25.52.172.269.967.261.652.942.613.412.611.410.77.14.34mM±±±±±±±±±±±±baaa4.35.32.14.02.94.85.43.94.95.14.85.672.270.965.959.350.136.113.412.210.19.94.12.08mM±±±±±±±±±±±±bb4.33.31.93.52.23.35.44.95.24.16.25.4（相同符号之间差异不显著，p>0.05）由表3-12可知，添加2mM，4mM浓度半胱氨酸均可显著提高精子卵裂率和囊胚率。而添加8mM时只能提高精子卵裂率，对囊胚率无显著影响。15 东北农业大学理学硕士学位论文3.3稀释液中添加不同浓度丁羟甲苯（BHT）3.3.1稀释液中添加不同浓度丁羟甲苯对精子活力的影响表3-13添加不同浓度丁羟甲苯对精子活力的影响Table3-13Effectsofsupplementedwithdifferentconcentrationscysteineonspermmotility天数DaysBHT01234567891091.586.884.480.575.269.662.555.843.635.327.60mM±±±±±±±±±±±2.72.25.34.81.95.45.64.32.95.84.391.590.688.286.585.782.277.971.865.559.153.90.2mMa±±±±±±±±±±±2.74.5a6.9ab4.3a5.7a8.1a4.5a6.3a5.35.0a2.1a91.590.189.286.382.277.674.368.461.353.849.70.4mM±±±±±±±±±±±2.71.6ab4.1a3.3a6.5b2.6b7.2b4.3b3.4b7.2b1.0b91.587.586.882.177.871.166.460.952.143.839.20.8mM±±±±±±±±±±±2.75.3b6.3b5.37.21.91.6c4.5c6.3c7.2c5.5c（相同符号之间差异不显著，p>0.05）由表3-13可知，稀释剂中添加不同浓度丁羟甲苯均可显著提高精子活力，并且各组间存在显著差异。其中添加0.2mM效果最佳。0.8mM效果相对较差，但仍可在一周内维持60%以上的活力。3.3.2稀释液中添加不同浓度丁羟甲苯对精子活率的影响表3-14添加不同浓度丁羟甲苯对精子活率的影响Table3-14EffectsofsupplementedwithdifferentconcentrationsBHTonspermviability天数DaysBHT01234567891095.591.791.587.383.678.276.572.768.462.953.70mM±2.7±4.8±4.3±2.1±9.0±6.7±8.1±4.6±3.6±3.9±7.1aa95.593.492.190.488.586.182.978.772.865.260.00.2mM±2.7±2.3±4.9±6.1±7.2±4.2±6.2±4.3±1.1±7.4±2.5baaaaaba95.593.691.590.587.385.283.177.368.564.558.90.4mM±2.7±6.2±3.8±6.5±4.2±7.1±1.6±5.3±6.9±5.4±3.3baaaaaba95.592.290.888.284.078.276.173.569.263.456.70.8mM±2.7±1.8±4.2±5.5±5.9±4.3±6.2±7.1±2.9±5.5±6.5abab（相同符号之间差异不显著，p>0.05）由表3-14可知，稀释剂中添加0.2mM和0.4mM丁羟甲苯均可显著提高精子活率，添加0.8mM则对精子活率无影响。16 结果3.3.3释液中添加不同浓度丁羟甲苯对精子顶体完整率的影响表3-15添加不同浓度丁羟甲苯对精子顶体完整率的影响Table3-15EffectsofsupplementedwithdifferentconcentrationsBHTonpercentagesofacrosome-integratedsperm天数DaysBHT01234567891097.396.794.590.387.683.580.477.369.863.554.70mM±±±±±±±±±±±2.73.46.46.77.32.75.44.36.7b5.84.397.396.995.091.389.486.383.280.776.471.964.30.2mM±±±±±±±±±±±2.72.35.64.37.16.0a8.3a6.7a4.9a0.8a1.6a97.395.294.589.888.184.981.379.873.268.960.20.4mM±±±±±±±±±±±2.74.67.15.46.75.32.0a3.6a2.85.7b3.4b97.394.593.290.788.084.381.276.070.264.456.30.8mM±±±±±±±±±±±2.75.07.14.46.78.04.2ab5.7ab4.35.16.3（相同符号之间差异不显著，p>0.05）由表3-15可知，稀释液中添加0.2mM和0.4mM丁羟甲苯均显著提高精子顶体完整率，0.2mM效果更佳，添加0.8mM效果则与对照组无显著差异。3.3.4释液中添加不同浓度丁羟甲苯对精子弯尾率的影响表3-16添加不同浓度丁羟甲苯对精子弯尾率的影响Table3-16Effectsofsupplementedwithdifferentconcentrationscysteineonpercentagesofspermtailcoiling天数DaysBHT01234567891094.692.585.783.680.378.474.365.759.554.243.10mM±±±±±±±±±±±2.75.46.43.87.23.97.53.6a4.07.64.294.693.487.288.584.683.180.974.666.660.253.90.2mM±±±±±±±±±±±2.71.93.24.3a6.0a4.6a3.8a3.95.5a7.3a5.4a94.693.786.587.485.082.179.673.962.458.751.10.4mM±±±±±±±±±±±2.73.56.32.9a4.3a1.7a5.6a7.85.6b3.2b1.9b94.692.684.684.281.279.076.272.561.253.745.90.8mM±±±±±±±±±±±2.75.63.96.35.72.47.05.66.34.63.8（相同符号之间差异不显著，p>0.05）由表3-16可知，稀释液中添加0.2mM，0.4mM，均能显著提高精子弯尾率，0.2mM效果好于添加0.4mM。添加0.8mM效果则与对照组无显著差异。17 东北农业大学理学硕士学位论文3.3.5释液中添加不同浓度丁羟甲苯精子对DNA损伤率的影响表3-17添加不同浓度丁羟甲苯对精子DNA损伤率的影响Table3-17EffectsofsupplementedwithdifferentconcentrationsBHTonpercentagesofspermDNAdamage天数DaysBHT0123456789108.211.413.517.419.825.628.836.742.550.259.30mM±±±±±±±±±±±3.74.56.53.85.78.43.55.46.24.74.68.29.711.915.817.419.022.328.935.444.247.30.2mM±±±±±±±±±±±3.74.93.74.86.64.2a5.6a5.9a5.7a4.5a6.2a8.29.812.016.817.323.327.433.940.447.553.70.4mM±±±±±±±±±±±3.74.94.25.85.06.13.12.53.82.74.88.210.612.517.618.123.928.934.541.251.360.70.8mM±±±±±±±±±±±3.74.81.93.26.15.52.84.53.23.33.2（相同符号之间差异不显著，p>0.05）由表3-17可知，添加0.2mMBHT可以显著降低精子DNA损伤率。添加0.4mM和0.8mMBHT均与对照组无显著差异。3.3.6稀释液中添加不同浓度丁羟甲苯精子体外受精卵裂率和囊胚率表3-18添加不同浓度丁羟甲苯对精子体外受精卵裂率和囊胚率的影响Table3-18EffectsofsupplementedwithdifferentconcentrationsBHTonratesofcleavageandblastocystBHT卵裂率囊胚率天数Days024681002468100mM72.270.466.455.340.328.713.412.610.27.43.10.0±±±±±±±±±±±±b4.32.75.64.96.87.25.46.72.16.88.90.00.2mM72.269.267.361.451.939.813.413.012.110.47.53.1±±±±±±±±±±±±aaaaaa4.35.64.95.47.43.85.45.06.75.43.22.50.4mM72.271.266.257.642.729.613.412.611.08.24.22.0±±±±±±±±±±±±a4.33.46.47.62.31.05.45.32.66.43.95.40.8mM72.270.965.154.341.527.113.412.27.84.00.00.0±±±±±±±±±±±±abb4.37.23.54.52.87.65.42.72.68.50.00.0（相同符号之间差异不显著，p>0.05）由表3-18可知，添加0.2mMBHT可以显著提高精子的卵裂率和囊胚率。添加0.4mMBHT与对照组无显著差异。添加0.8mMBHT不但对卵裂率无影响，而且使囊胚率显著下降。18 结果3.4更换稀释液表3-19更换稀释液对精子质量的影响Table3-19Theeffectofreplacementofextendersonspermquanlity天数Days01234567891091.290.688.286.585.768.261.953.840.530.117.9活力±2.7±±±±±±±±±±5.24.51.77.25.64.33.22.88.95.495.593.492.190.488.586.182.967.754.842.233.1活率±2.7±±±±±±±±±±4.37.54.56.46.05.56.37.36.47.997.396.995.091.389.471.363.254.747.435.922.3顶体±2.7±±±±±±±±±±2.3完整性1.92.74.78.12.35.75.32.37.994.693.490.288.584.673.165.954.649.643.227.9弯尾率±2.7±±±±±±±±±±7.31.92.35.64.52.37.85.43.02.78.2±9.411.615.917.427.732.639.748.155.264.3DNA3.7±±±±±±±±±±7.3损伤率4.76.25.07.53.92.84.43.24.778.270.265.344.437.925.8卵裂率±4.3±±±±±3.85.64.95.47.413.413.06.13.20.00.0±囊胚率±5.4±±±±0.05.06.71.40.0（相同符号之间差异不显著，p>0.05）由表3-19可知，精子的各项指标在前五天左右的时候，无显著差异，但五天后各项指标都发生明显下降。19 东北农业大学理学硕士学位论文4讨论4.1精子质量评价目前常用的评价方法有:检测活率、活力和顶体完整率等。其中测定精子运动能力(活力)的方法简单、快速，因而得到广泛应用。以前，人工授精技术常常只看精子活力。但是，现代实验证明，活力高但顶体损伤的精子己丧失了受精能力。因而，有必要检测常温保存过程中顶体的损伤程度，因为顶体对受精极为重要。精液中畸形顶体数高的公猪，往往是不育或受精力低的。所以，一般把顶体完整率也作为检测精子质量的一项重要指标。另外，精子质膜的完整性，也是影响受胎率的一个重要因素。精子质膜的重要性在于它能够有选择地运输分子。当把精子放置于低渗条件下时，水会进入精子内部并要达到一个平衡，这种内流的水会使精子体积增大，质膜肿胀。因而可以通过精子经低渗处理后弯尾能力来检测质膜完整性。早在1966年，Drebius和Eriksson就曾描述过哺乳动物精子的弯尾现象。从那以后，许多研究都证明，低渗肿胀法有助于预测精子对卵子受精的能力(Correa等，1994)。尽管在研究中不同精子参数相关性有差异，但肿胀弯尾率与精子获能率、穿卵率和精子活力显著相关(Kumi-diaka，1992)。同时，Rogers和Parker发现，精子低渗肿胀法的检测结果与精子穿透率检测结果在统计学上显著相关(Rogers，1991)。精子核染色体中，鱼精蛋白取代组蛋白，增加了二硫键的结构，使得染色体高度凝集(Balhorn,1982)。这使得精子DNA对物理和化学损伤有很强的抵抗力。精液质量不佳不仅会产生大量的ROS，而且会对氧化应激导致的DNA损伤更为敏感（StephanieLopesetal.,1998）。有人发现质量不好的精子DNA损伤率要远远高于正常的可孕精子(Sunetal.,1997；Lopesetal.,1998)。另外，有研究证明了精子DNA损伤率与体外受精率(Sunetal.,1997)和ICSI率(Lopesetal.,1998)成负相关。不同的研究者由于采用的评价方法不同，为此，我们采用精子活率、活力、弯尾率和顶体完整率、DNA损伤率和体外受精六种精子评价方法对不同处理后精液的精子质量进行评价，得到了较为可靠的实验结果。4.2谷胱甘肽的效果冷冻解冻后猪精子中GSH含量显著降低，所以可以在精液冷冻液中加入适量的GSH对精子进行保护。易康乐等(2005)在水牛精液冷冻保存液中加入300U/mlSOD或1.0rnmol/LGSH，可以显著提高精子冷冻解冻后活率(P<0.05)，特别是两者共同加入时效果更明显。张文举等(1997)对GSH研究也发现，在冻前于牛稀释精液中添加GSH可极显著地提高精子活率和存活时间(P<0.0l)，发情期受胎率也得到显著提高(P<0.05)。GadeaJ等(2005)测定了在冷冻一稀释液中添加GSH的保护效果，添加5mMGSH对冷冻解冻后精子质量和受精率并没有显著效果。而在解冻液中添加GSH可以明显观察到提高精子的受精率，并且具有剂量依赖性。目前的研究显示，10℃保存猪精液过程中，添加5mMGSH或半胱氨酸可以提高精子活力和功能完整性。研究显示，在冷冻（WangAWetal.,1997）和长期保存的过程中，ROS都会损害精子的活力和完整性（AitkenRJ,ClarksonJS.1988）添加GSH可以提高小鼠活力和顶替完整性，而且增加抗氧化剂的含量可以线性提高精子活率（MaxwellWM,StojanovT，1996）。本试验在常温保存稀释液中添加GSH，以期得到保护猪精子的作用。结果显示，向稀释液中添加1mM，5mMGSH均能提高精子活力、活率、顶替完整率、弯尾率、卵裂率和囊20 讨论胚率。而且精子在10天后活力依然能维持在30%以上。也就是仍具备人工授精的条件。并且添加GSH同样降低了精子的DNA损伤率。其中添加1mMGSH效果最佳这可能由于GSH是GPX和GR系统的辅助因子，能够调节酶的活性，保护精子膜上多不饱和脂肪酸免受氧化，在抵抗脂质过氧化中起到了重要作用。GadeaJ（2008）等和DonellyET等（2000）则发现GSH能够提高牛和人精子活力，保护精子DNA免受ROS损伤。在人，TarinJJ等（1998）和DonnellyET等（1999）发现，一定浓度的GSH能够提高人精子体外受精能力，并能保护DNA链的完整性。这些研究结果以及我们的实验结果都可以说明在猪精子常温保存方面，GSH能够具有同样的功能。另外，添加10mMGSH对精子保存的各项指标无显著提高，这与GSH的添加量可以线性提高精子活率的研究结果不符。4.3半胱氨酸的效果巯基乙胺、β－巯基乙醇、半胱氨酸、胱氨酸等含硫氨基酸等一些不同种类低分子量的硫醇类物质，可诱导卵母细胞中GSH的合成（LuberdaZ,2005）在补充半胱氨酸或半胱胺的培养液中，卵丘细胞还能够促进卵母细胞对半胱氨酸或半胱胺的吸收，使卵母细胞从培养液中获得充足的GSH合成底物（deMatosDGetal.,1997）。BilodeauJF等（2001）证明像半胱氨酸之类的巯醇物质，可以保护冷冻-解冻后的牛精子活力免受过氧化氢的伤害。最近研究显示（BilodeauJFetal.,2001）GSH和半胱氨酸有效阻止冷冻解冻中过氧化氢诱导的活力丧失。还有研究发现，GSH和半胱氨酸都可以提高猪精液的液态保存。添加1.27mM半胱氨酸可以维持精子DNA完整性。H.Funahashia,和T.Sano（2005）证明，10℃下添加半胱氨酸可以提高猪精子的活力、顶体完整性和体外穿透性。目前研究发现，半胱氨酸可以提高猪精液的液态保存。本实验结果显示向稀释液中添加2mM，4mM半胱氨酸均能提高精子各项指标，更可以维持8天60%以上的活率，其中2mM效果更显著。添加8mM效果则较为不明显，并未显著提高顶体完整率、降级DNA损伤率。这说明半胱氨酸作为细胞内谷胱甘肽生物合成的前体（MeisterA,TateSS1976）对维持精子各项生理指标，抵抗DNA损伤有很明显的效果，而且可以显著维持保存过程中精子的卵裂率和囊胚率。4.4丁羟甲苯的效果近年来,研究发现在哺乳动物液态精液中添加丁羟甲苯可以有效保护精子的质膜完整性,降低冷休克对猪、羊和牛的精子损伤。Roca等研究指出,在冷冻稀释液中添加0.025-3.2mM/LBHT能够有效抑制精子质膜过氧化反应,当BHT浓度在0.2-1.6mM/L时,精液中脂质过氧化反应产物—丙二醛(MDA)的含量最低(P<0.05);在乳糖-蛋黄-甘油-OEP稀释精液中,分别添加0.2、0.4、0.8和1.6mM/LBHT后冷冻于0.5mL麦管,解冻后0.5h和2.5h检测发现,0.2、0.4和0.8mM/L组的精子活率较高(P<0.05);此外,添加0.4mM/LBHT可使受精卵发育到囊胚的百分率显著提高(P<0.05),但有趣的是受精卵的卵裂率却未受BHT的影响。抗氧化剂BHT可以抵抗猪精液的冷应激（BambaK,CranDG,1988）尽管BHT改善了牛精子和火鸡精子(Donoghue,1997)的冷应激(GrahamandHammerstedt,1992)和冷冻保存(Killianetal,1989)效果，并在冷冻马精子中有毒害作用(Balletal,2001)。并且Roca等人发现在冷冻稀释液中添加1.6mM没有作用(Rocaetal,2004)。另外，BambaandCran(1992)发现，BHT浓度高于2mM时对精子冷应激失去保护作用。实验结果显示，常温保存过程中，向稀释剂中添加0.2mM和0.4mM丁羟甲苯均可显著提21 东北农业大学理学硕士学位论文高精子精子活力、活率、顶体完整率、弯尾率。但只有添加0.2mM时可显著降低精子DNA损伤率。添加0.8mMBHT在维持精子各项指标方面均未显示正面作用，反而在保存四天后显著降低了精子的囊胚率。有研究显示，BHT不但不会提高精子各项参数而且在稀释液中添加1.6mM时会产生负面影响。马精液5℃保存添加BHT无影响并降低活力。本试验也印证了，高浓度的BHT非但不会对精子起到保护作用，反而会在一定条件下降低精子质量这一观点。4.5更换稀释液的效果氧自由基可由酶促代谢产生，也可以由非酶促的化学反应或物理辐射等诱导产生。产生ROS的非酶促反应主要有：还原型生物分子的自氧化反应、Fenton型和Habor-Weiss反应、脂质连锁反应和药物代谢等反应过程。在正常生理情况下，自由基不断地产生，同时也不断地被清除，使自由基的浓度维持在一定浓度内因而对机体有利无害。少量自由基是机体维持正常生命活动所必需的，因此，可以理解在一定情况下，自由基适度增多对机体是有利的，它可能激发某些反应过程或提高酶的活性，同时机体的抗氧化体系的活动也相应增强。如吞噬细胞在吞噬细菌、异物的过程中，发生所谓呼吸爆发过程，生成大量的活性氧（包括氧自由基），起到杀灭细菌、促进降解的作用（凌亦凌等，1994）。机体内存在的抗氧化体系，由多种抗氧化酶类和抗氧化剂组成，以加速自由基的清除。虽然ROS是精子发生和顶体反应所产生的正常生理学产物(deLamirandeandGagnon,1993;deLamirandeetal.,1993)。但精浆中过多的ROS会导致精子形态学，活力，和精子数的降低(Aitkenetal.,1989;Mazzillietal.,1994)。本实验中每日更换稀释液，起到了清除保存过程中产生的ROS的作用，从而在一定程度上减少了ROS对精子的损害。但是结果显示，这种维持作用只能存在五天左右，之后各项指标均呈现出明显下降的趋势。这可能是由于在常温条件下，精子的新陈代谢并没有停止，代谢产物对精子的各项指标均有影响，并且每日吸取稀释液的过程打破了精液固有的平衡体系，对精子也造成了一定伤害。单纯减少ROS已经不能抵消其所受的损伤。但可以预测更换稀释液的同时添加抗氧化剂可能会在一定程度上弥补这种损伤，是一种可行的保存液态精子的方法。22 讨论5结论1.向稀释液中添加1mM，5mMGSH均能显著提高精子保存质量。其中添加1mM效果最好。2.向稀释液中添加2mM，4mM半胱氨酸均能提高精子保存质量。其中2mM效果最好。3.稀释剂中添加0.2mM丁羟甲苯，能显著提高精子保存质量。4.更换稀释剂的方法使得精子在前五天各项指标维持良好状态，五天后精子各项指标显著下降。23 东北农业大学理学硕士学位论文致谢时光荏苒，2009年春夏交替之季，我将为我的学生时代画上一个句点。在东农求学的七年时光，我从一个懵懂少年成长为一个三十而立的青年，不仅经历了从青涩到从容的心路历程，累积了规划未来人生的动力，亦给我留下了无数的感动和美好回忆。在这七年时光中，是你们——我亲爱的老师、同学、朋友和家人帮助我、扶植我并见证了我的成长和进步，感谢你们，你们的指导、支持、帮助和陪伴是我一生的财富。首先我要感谢在我课题研究中给与我教导的恩师们。感谢我的硕士学位导师周佳勃副教授，是您让我对胚胎工程产生了浓厚的兴趣，并带领我进入了这一领域。感谢您对我的无私关怀和帮助。您具有严谨的学术作风，儒雅的为人师表，敬业的工作态度，活跃的思维和积极的生活态度，但您同时又是我们生活中的伙伴和益友，您所给予我的启迪和帮助将使我受益终生。感谢刘忠华教授，是您学习生活中给予我的殷切的教诲和悉心指导，使我顺利完成了学习任务和课题研究。感谢朱佳伟、王中伟、王媛、曹效彰等同门的师兄弟姐妹们，感谢你们在学习和生活上所给与的帮助和关心，与你们的友谊是我宝贵的财富。感谢我的父母家人亲人们对我在物质上和精神上的支持和帮助，你们的陪伴和信任将是我进取的无穷动力。孙琪2009年5月24 参考文献参考文献高飞,岳奎忠,杨增明.2004.猪精液液态保存的研究进展.中国畜牧杂志.40(6):46~49郭志勤等编著.1998.家畜胚胎工程.中国科学技术出版社.第130页蒋如明.2005.母猪乏情的处理方法.养猪技术顾问.(4):21康文彪.1992.概述猪人工授精工作的进展和现状.中国畜牧杂志.28(5):57~581林海萍，商学军，傅健.2000.Perroll梯度离心前后精子功能指标分析.中~男科学.6(3):163刘金荣，路华.1992.男性生育力的研究:三种精子功能测定方法的比较.男性学杂志.6(l):18~21细胞生物学实验指导.李素文主编.2001.高等教育出版社施普林格出版社.10月第1版晓春.2001.改善母猪繁殖性能的营养措施.中国饲料.(4):18~20易康乐，谢英，黄卫红等.2005.水牛冷冻精液稀释液中添加SOD、GSH对精子品质的影响.广西畜牧兽医.21(5):201~204张文举，杨军祥，黄全威等.1997.谷胧甘肽提高牛冻精活力及受胎率的研究.甘肃畜牧兽医.27(2)：12~13Aitken,R.J.,Buckingham,D.,West,K.etal.1992.Differentialcontributionofleukocytesandspermatozoatothehighlevelsofreactiveoxygenspeciesrecordedintheejaculatesofoligozoospermicpatients.JReprodFertil,94:451~462AbeydeeraLR,DayBN.1997.FertilizationandsubsequentdevelopmentinvitroofpigoocytesinseminatedinamodifiedTris-bufferedmediumwithfrozen-thawedejaculatedspermatozoa.BiolReprod,57:729~734AgarwalAandSalehRA.2002.Roleofoxidantsinmaleinfertility:rationale,signi®cance,andtreatment.UrolClinNAm29:817~827AgarwalA,SaidTM.2005.Oxidativestress,DNAdamageandapoptosisinmaleinfertility:aclinicalapproach.BJUInt,95:503~507AgarwalA,SalehRAandBedaiwyMA.2003.Roleofreactiveoxygenspeciesinthepathophysiolologyofhumanreproduction.FertilSteril,79:829~843AitkenRJandKrauszC.2001.Oxidativestress,DNAdamageandtheYchromosome.Reproduction,122:497~506AitkenRJ,ClarksonJS.1988.Significanceofreactiveoxygenspeciesandantioxidantsindefiningtheefficacyofspermpreparationtechniques.JAndrol,9:367~76AitkenRJ.1999.TheAmorosoLecture.Thehumanspermatozoon--acellincrisis?JReprodFertil,115(1):1~7AitkenRJ.,Clarkson,JS.,Hargreave,TB.etal.1989.Analysisoftherelationshipbetweendefectivespermfunctionandthegenerationofreactiveoxygenspeciesincasesofoligozoospermia.J.Androl,10:214~220AlvarezJG,StoreyBT.1989.Roleofglutathioneperoxidaseinprotectingmammalianspermatozoafromlossofmotilitycausedbyspontaneouslipidperoxidation.GemeteRes,23(1):77~90ArmstrongJS,RajasekaranM,ChamulitratW,GattiP,HellstromWJ,SikkaSC.1999.Characterizationofreactiveoxygenspeciesinducedeffectsonhumanspermatozoamovementandenergymetabolism.FreeRadicBiolMed,26:869~80Balhorn,R.1982.Amodelforthestructureofchromatininmammaliansperm.CellBiol,93:298~305BallBA,MedinaV,GravanceCG,BaumbeJ.2001.Effectofantioxidantsonpreservationofmotility,viabilityandacrosomalintegrityofequinespermatozoaduringstorageat5ºC.Theriogenology,56:577~589Bamba,K.,Cran,D.G.1992.Effectsoftreatmentwithbutylatedhydroxytoluenespermatozoatocoldstressanddilution.ReprodFertil,95:69~7725 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东北农业大学理学硕士学位论文PurselVG.1979.Effectofcoldshockonboarspermtreatedwithbutylatedhydroxytoluene.BiolReprod,21(2):319~24RocaJ,GilMA,HernandezM,ParrillaI,VazquezJM,MartinezEA.2004.Survivalandfertilityofboarspermatozoaafterfreeze-thawinginextendersupplementedwithbutylatedhydroxytoluene.JAndrol,25:397~405SalehRA,AgarwalA,KandiraliE,SharmaRK,ThomasAJJr,NadaEA,EvensonDPandAlvarezJG.2002.Leukocytospermiaisassociatedwithincreasedreactiveoxygenspeciesproductionbyhumansperm.FertilSteril,78:1215~1224SellesE,GadeaJ,RomarR,etal.2003.Analysisofinbitrofertilizingcapacitytoevaluatethefreezingproceduresofboarsemenandtopredictthesubsequentfertility.ReprodDomestAnim,38:66~72SharmaRKandAgarwalA.1996.Roleofreactiveoxygenspeciesinmaleinfertility.Urology,48:835~850SinghNP,McCoyMT,TiceRR,SchneiderEL.1988.AsimpletechniqueforquantitationoflowlevelsofDNAdamageinindividualcells.ExpCellRes,175:184~191StephanieLopes,AndreaJurisicova,Jian-GuoSunandRobertF.1998.Casper1Reactiveoxygenspecies:potentialcauseforDNAfragmentationinhumanspermatozoa.HumanReproduction,13:.896~900StoreyBT.1997.Biochemistryoftheinductionandpreventionoflipoperocidativedamageinhumanspermatozoa.MolHumReprod,3(3):203~213Strze_zekJ,KordanW.2003.Effectsofdecondensingagentsonchromatinstabilityofboarspermatozoa–radioisotopestudy.AnimalSciPapRep,21:167~181StrzezekJ,LapkiewiczS,LecewiczM.A.1999.noteantioxidantcapacityofboarseminalplasma.AnimalSciencePaperandReports,17(4):181~188StrzezekJ.2002.Secretoryactivityofboarseminalvesicleglands.ReprodBiol,2(3):243~266Sun,JG,Jurisicova,A.andCasper,R.F.1997.Detectionofdeoxyribonucleicacidfragmentationinhumansperm:correlationwithfertilizationinvitro.Biol.Reprod,56:602~607SuttigotinCJ,ThwatiesLG,Sanchez-pantida,etal.1995.Evalutionofamodifiedspermpenetrationestinramsemen.Theriogenology,44(1):29~40ThomasCA,GarnerDL，DejarnetteJM,etal.1997.Fluorometricassessmentsofacrosomal,56(4):991~998TwiggJ,Fulton,NandGomezE.1998.Analysisoftheimpactofintracellularreactiveoxygenspeciesgenerationonthestructuralandfunctionalintegrityofhumanspermatozoa:lipidperoxidation,DNAfragmentationandtheeffectivenessofantioxidants.HumReprod,13:1429~1436VazquezJM,EAMartinez,Martinez,PMartinez,CGarcia-ArtigaandJRoca.1997.Hypoosmoticswellingofboarspermatozoacomparedtoothermethodsforanalyzingthesermmembrane.Theriogenology,47:913~922VerstegenJ,Iguer-OuadaM,OnelinK.2001.Computer-assistedsemenanalysersinandrologyresearchandveterinarypractice.JAndrol,22:104~110WangAW,ZhangH,IkemotoI,AndersonDJ,LoughlinKR.1997.Reactiveoxygenspeciesgenerationbyseminalcellsduringcryopreservation.Urology,49:921~925Xu,Pommier,Arbov,etal.1998.Invitromaturationandfertilizingfunctionsinvitro.BiologyofReproduction,58:539~550YoshidaM.2000.Conservationofsperms:currentstatusandnewtrends.AnimReprodSci,60/61:349~55Zou,Yang.2000.Evaluationonspermqualityoffreshlyejaculatedboarsemenduringinvitrostorageunderdifferenttemperatures.Theriogenology,53:1477~1428 附录附录附表一：洗卵液（PVA-TL-HEPEs）的配制：PVA-TL-HEPEsChemicalg/1000mlNaCl6.6633KCl0.2386NaHCO30.1680KH2PO40.0408NaLactate1.868mlMgCl2·6H2O0.1017HEPES2.3830PenicillinG0.0650PhenolRed0.0100CaCl2.2H2O0.2940PVA0.1000Sorbitol2.1860Gentamicin(mg/ml)0.0250Pyruvate0.0220Osmolarity(mOsm)275-280PH7.0-7.2附表2：成熟培养液（Maturationmedium）的配制：MaturationmediumChemicalg/1000mlTCM-199PVA1D-glucose0.5496Sodiumpyruvate0.1001PG75ug/mlSM50ug/ml附表三：胚胎培养液（PZM-3，PigZygotesMedia-3）的配制:PZM-3Chemicalg/100mlNaCl0.6312KCl0.0746KH2PO40.0048MgSO4·7H2O0.0099NaHCO30.2106Na-Pyruvate0.0022Ca-(Lactate)2.5H2O0.0617L-Glutaurine0.0146Hypotaurine0.0546BME2ml29 东北农业大学理学硕士学位论文附表四：操作液（Manipulationmedium）的配制:ManipulationmediumChemicalg/100mlTCM-1999.500NaHCO30.050Hepes0.750NaCl1.855PenicillinG0.050Streptomycin0.060BSA3.0Osmolarity(mOsm)280PH7.2-7.4附表五：孵育液（Treatmentmedium）的配制：TreatmentmediumChemicalg/100mlGlucose0.218SodiumPyruvate0.055NaCl0.661CaCl20.022CaCl22H2O0.110Tris0.242Caffeine0.021BSA0.100附表六：稀释液（Extender）的配制：ExtenderChemicalg/100mlGlucose1.150NaHCO30.175TrisodiumCitrate1.165EDTA0.235Tris0.550CitricAcid0.410Cysteine0.007BSA0.50030 附录图版31 东北农业大学理学硕士学位论文图版说明A．F型，整个精子头部有均一荧光，为未获能，顶体完整的精子。100×B．AR型，整个精子头部无荧光或非常弱的荧光，为顶体不完整精子，即发生了顶体反应的精子或顶体缺损的精子。100×C．精子头部顶体后区，在靠近尾部的部分无荧光或非常弱的荧光而头前部为均一荧光，为获能且顶体完整的精子。100×D．被染为蓝色的即死精子（如箭头所示），其余均为活精子。200×E．DNA未发生损伤的精子。200×F．DNA损伤的精子。200×G．卵裂胚胎。40×H．囊胚。40×32 附录攻读硕士期间发表的文章孙琪，岳顺利，周佳勃.2008.哺乳动物卵母细胞和胚胎冷冻损伤研究进展.安徽农业科学.36（6）：2355~235633
