小麦—华山新麦草衍生后代分子细胞遗传学及其纹枯病抗性鉴定评价

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分类号：S512.1学校代码：10712UDC：631研究生学号：2015050028密级：公开2018届攻读硕士学位研究生学位（毕业）论文小麦-华山新麦草衍生后代分子细胞遗传学及其纹枯病抗性鉴定评价学科专业作物学研究方向作物遗传改良与种质创新研究生刁慧珊指导教师陈新宏研究员武军副研究员完成时间2018.5.20中国陕西杨凌 Classificationcode:S512.1Universitycode:10712UDC:631Postgraduatenumber:2015050028Confidentialitylevel:PublicThesisforMaster’sDegreeNorthwestA＆FUniversityin2018CYTOLOGICALIDENTIFICATIONANDEVALUATIONOFTHERESISTANCETOSHARPEYESPOT(RIZOCTONIACEREALIS)OFPROGENYOFWHEAT-PSATHYROSTACHYSHUASHANICAKENGMajor:CropGeneticsandBreedingResearchfield:MolecularBreedingofWheatNameofPostgraduate:DiaoHuishanAdviser:Prof.ChenXinhongCo-adviser:Prof.WuJunDateofsubmission:2018/05YanglingShaanxiChina 研宄生学位论文的独创性声明本人声明：所呈交的专业学位颂士论文是我个人在导师指导下独立进行的研究工作及取得的研究结果论文中的研究数据及结果的获得完全符合学校；《关于规范西北农林科技大学研究生学术道德的暂行规定》如果违反此规定一，，切后果与法律责任均由本人承担。尽我所知，论，除了文中特别加以标注和致谢的地方外文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究结果，也不包含其他人和自己本人已获得西北农林科技大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料一。与我同工作的同事对本研究所做的任何贡蚨均已在论文的致谢中作了明确的说明并表示了谢意，研究生签名：』嚷辦时间：年６月６日导师指导研究生学位论文的承诺本人承诺：我的专业学位硕士研究生所呈交的硕士学位论文是在我指导下独立开展研究工作及取得的研究结果属于我现岗职务工作的结果，并严格按照，学校《关于规范西北农林科技大学研究生学术道德的暂行规定》而获得的研究结果．如果违反学校《关于规范西北农林科技大学研究生学术道德的暂行规定》接受按学，我愿校有关规定的处罚处理并承担相应导师连带责任？导师签名时间：年６月６日Ｉ 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小麦-华山新麦草衍生后代分子细胞遗传学及其纹枯病抗性鉴定评价摘要小麦纹枯病（wheatsharpeyespot）是世界范围内影响小麦产量和品质的重要病害之一，近年在我国各小麦主产区发生面积和危害程度呈明显加重趋势，因普通小麦中抗源稀缺，有必要在小麦近缘种属挖掘新的抗源。华山新麦草（PsathyrostachyshuashanicaKeng,NsNs，2n=14）具有很强的抗逆、早熟和抗病等多种优异的生物学特性，是小麦重要的野生近缘种质资源种。本研究利用细胞学观察、基因组原位杂交（GISH）和分子标记（SSR和EST-STS）技术，对课题组近期创制的59份小麦-华山新麦草衍生后代进行分子细胞遗传学分析；采用纹枯病温室牙签接种法对该59份材料和97份引进美国小麦材料和国内改良品种进行纹枯病抗性鉴定，结合田间农艺性状，筛选优良的纹枯病抗性材料，并对稳定的抗性材料进行SSR和SNP分析，主要结果如下：1.59份小麦-华山新麦草衍生后代材料综合细胞学观察、基因组原位杂交（GISH）和分子标记（SSR和EST-STS）鉴定分析，18-1-3-1-6-2-2为小麦-华山新麦草2Ns(2D)异代换系，其余的根尖细胞均含有42条染色体，无明显外源信号，推断其可能导入了小片段Ns基因组染色体，为易位系或渐渗系。2.采用纹枯病温室牙签接种法，对该59份材料和97份引进美国小麦材料和国内改良品种进行纹枯病抗性筛选鉴定，中抗及以上种质36份，包括10份国内改良品种，16份引进美国小麦材料和10份小麦-华山新麦草衍生后代。对这部分材料进行田间农艺性状调查，小麦-华山新麦草衍生后代Y-83-1和Y-83-3两年表现抗病，且综合农艺性状较好，可作为小麦纹枯病抗病育种的稳定抗源。3.对36份纹枯抗性较好的材料利用SSR分子标记分析，检测到504个等位变异，变幅2~23，平均等位变异8.40；多态性聚类分析表明，引进美国小麦材料遗传多样性较高，和小麦-华山衍生后代亲缘关系较远；抗性位点标记验证结果表明，与抗性QTLs连锁的Xwmc154、Xbarc126可用于分子标记辅助育种。对综合农艺性状和抗性皆较好的小麦-华山新麦草衍生后代Y-83-1和Y-83-3进行SNP分子标记分析，进一步明确了它们的遗传组成。这些小麦-华山新麦草衍生后代抗纹枯病材料的筛选鉴定，对小麦纹枯病种质创新和品种改良奠定了材料和理论基础。关键词：小麦；华山新麦草；基因组原位杂交；纹枯病 THEPROGENYOFWHEAT-PSATHYROSTACHYSHUASHANICAKENGCYTOGENETICSRESEARCHANDEVALUATIONOFWHEATGERMPLASMSRESISTANTTOSHARPEYESPOT(RIZOCTONIACEREALIS)ABSTRACTWheatsharpeyespot,oneofthemostimportantdiseases,hasaffectedworldwidewheatyeildandquality,Inrecentyears,itsoccurrenceareaanddamagedegreeinChinesemajorwheat-growingareashavebeenincreasingobviously.Becauseofthescarcityofresistantsourcesinwheat,itisnecessarytoexplorenewresistantresourceintherelatedspeciesofwheat.PsathyrostachyshuashanicaKeng(NsNs,2n=14),possessingmanyexcellentbiologicalcharacteristics,suchasgreatstresstolerance,prematurityanddiseaseresistance,isanimportantwildrelativeofwheat.Inthisstudy,cytologicalobservation,genomicinsituhybridization(GISH)andmolecularmarkers(SSR,EST-STS)wereusedtoidentify59wheat-P.huashanicaderivedlineswhichcreatedbyourgroupresentlytoclarifytheirchromosomeconstitutions.Greenhousetoothpickinoculation,combinedwithagronomiccharactersinvestigation,wasusedtoscreengreatresistantmaterialstowheatsharpeyespotfromabove59wheat-P.huashanicaderivedlinesand97adoptedAmericanmaterialsanddomesticimprovedvarieties.Thenmolecularmarkers(SSRandSNP)wereusedtoanalysethestableresistantmaterials.Themainresultsoftheexperimentwereasfollows,1.Theresultsofcytogeneticidentificationshowedthat18-1-3-1-6-2-2was2Ns(2D)substitutionline.Theroottipcellsofremainingmaterialsconsistedof42chromosomewithoutobviousexogenoussignals,thustheremainingmaterialsconjecturedtobeintroducedsmallfragmentsofchromosomederivedfromNsgenome,andbetranslocationlinesorintrogressionlines.2.Theresultsoftheindentificationofwheatresistancetosharpeyespotshowedthat36materialswithstablemoderate-resistancewereobtained,including10domesticimprovedvarieties,16adoptedAmericanmaterialsand10progeniesofwheat-P.huashanicaderivedlines.Theresultsofagronomictraitsof36resistantmaterialsshowedthatY-83-1andY-83-3hadgoodagronomictraitsandresistance,canbeusedasstableresistantmaterialsforwheatbreeding. 3.504allelevariationsweredetectedin36resistantmaterialsusingSSRmarkers,andtheallelenumberperlocuswas8.40,rangedfrom2to23.ThegeneticdiversityanalysisshowedthatadoptedAmericanmaterialshadhighergeneticdiversity,anditsrelationshiptowheat-P.huashanicaderivedlineswasdistant.ResistantlocianalysisindicatedthatXbarc126andXwmc154canbeusedformolecularmarkerassistedbreeding.ThegeneticconstitutionofY-83-1andY-83-3wereanalyzedusingSNPmarkes.Theidentificationoftheresistanceofwheat-P.huashanicaderivedlinestosharpeyespotcanlayamaterialandtheoreticalfoundationforgermplasminnovationandbreedimprovementagainstwheatsharpeyespot.KEYWORDS:Wheat,PsathyrostachyshuashanicaKeng,Genomicinsituhybridization,Sharpeyespot 目录第一章文献综述.......................................................................................................................11.1研究背景.......................................................................................................................11.2小麦根茎部真菌病害...................................................................................................11.2.1小麦纹枯病危害.................................................................................................21.2.2小麦纹枯病抗病遗传研究历史.....................................................................21.2.3纹枯病抗性相关基因研究进展..........................................................................31.3小麦近缘种属植物的利用...........................................................................................41.3.1小麦远缘杂交.....................................................................................................41.3.2染色体工程育种.................................................................................................41.3.3小麦近缘种属抗性.............................................................................................51.4小麦种质资源遗传的研究方法....................................................................................61.4.1形态学标记..........................................................................................................61.4.2细胞学标记.........................................................................................................61.4.3生物化学标记.....................................................................................................61.4.4原位杂交..............................................................................................................71.4.5分子标记.............................................................................................................71.5本研究的目的、意义及内容.......................................................................................81.5.1研究的目的和意义..............................................................................................81.5.2本研究的内容......................................................................................................8第二章小麦-华山新麦草衍生后代的鉴定.............................................................................92.1材料和方法...................................................................................................................92.1.1试验材料..............................................................................................................92.1.2试验方法...........................................................................................................102.2结果与分析..................................................................................................................112.2.1细胞学鉴定.......................................................................................................112.2.218-1-3-1-6-2-2的SSR分析.............................................................................122.2.318-1-3-1-6-2-2的EST-STS分析.....................................................................132.3讨论..............................................................................................................................13第三章小麦种质资源对纹枯病抗性鉴定与评价.................................................................153.1试验材料.....................................................................................................................15 3.2试验方法.....................................................................................................................153.2.1病菌接种............................................................................................................153.2.2病情调查与评价...............................................................................................163.2.3小麦农艺性状调查...........................................................................................163.2.4数据处理...........................................................................................................163.3结果与分析.................................................................................................................163.3.1156份小麦材料抗性鉴定初筛........................................................................163.3.2不同来源材料对纹枯病的抗性评价...............................................................163.3.3抗病材料农艺性状及其主成分分析................................................................183.4讨论.............................................................................................................................21第四章纹枯抗性材料的分子标记分析.................................................................................224.1试验材料......................................................................................................................224.2试验方法.....................................................................................................................224.2.1SSR分析...........................................................................................................224.2.290k芯片............................................................................................................224.2.3数据处理...........................................................................................................224.3结果与分析.................................................................................................................224.3.1抗病材料多态性分析.......................................................................................233.3.2抗病材料PCA分析.........................................................................................244.3.3抗病材料聚类分析...........................................................................................244.3.4抗性基因位点的SSR标记分析.....................................................................254.3.5Y-83-1和Y-83-3遗传分析.............................................................................264.4讨论.............................................................................................................................26第五章结论.............................................................................................................................285.1小麦-华山新麦草衍生后代的鉴定............................................................................285.2小麦种质资源对纹枯病抗性鉴定与评价.................................................................285.3纹枯抗性材料的分子标记分析.................................................................................28参考文献...................................................................................................................................29附录...................................................................................................................................36致谢...................................................................................................................................47作者简介...................................................................................................................................48 第一章文献综述1第一章文献综述1.1研究背景小麦（TriticumaestivumL.）是重要的粮食作物，种植范围遍布全球（HuangandRder2004）。根据国家统计年鉴2017数据，2016年我国的粮食总产量为6.16亿t，同比上一年下降0.84%，较2014年增长1.52%。其中，小麦产量为1.29亿t，同比上一年下降1.03%，较2014年增长2.09%。总体而言，我国小麦总产量呈增长态。当前，小麦作为第三大粮食作物（次于玉米和水稻），对我国粮食市场及人民的衣食住行有重要作用。主要消费有口粮、工业、饲料及种子等，其中，口粮消费占大部分。人类膳食中，小麦是植物蛋白的最大来源，也是人体碳水、矿物元素、维生素等的供源(Anonymous2006)。食用用的小麦籽粒，一方面需要好的加工品质，另一方面需要好的食用品质。保证产量，提高品质，是当前小麦育种的重要任务。小麦真菌病害的发生及流行对小麦品质提高及稳产高产起制约作用（侯丽媛2016）。小麦纹枯病多发生于我国小麦主产区，是主要的土传根茎部真菌病害，90%以上由无性型真菌门真菌的禾谷丝核菌侵染引起。小麦纹枯病大规模流行时，不仅会降低小麦产量，还会对我国粮食安全造成威胁（刘万才等2016）。选育抗病品种是防治小麦纹枯病的大规模发生及其流行的最为安全有效的方法。发掘新抗源，拓宽小麦遗传谱，培育抗小麦纹枯病的新品种(系)，并加以推广种植是重要的育种任务。华山新麦草属新麦草属（PsathyrostachysNevski），大麦族（TriticeaeDumort），禾本科（Gramineae），主要分布于我国华山地区，是我国特有的多年生草本植物（Kuo1987；Baden2010）。华山新麦草具有很多优良性状，包括早熟，多有效分蘖，抗逆性好，对条锈、白粉、全蚀等病等真菌病害抗性优良等（井金学等1999；Kangetal.2008,2009；王美南和商鸿生2000）。华山新麦草是小麦作物遗传改良的重要的基因供体，它与普通小麦的远源杂交近年来引起了越来越多的育种学家的重视。由于原产地气候环境的多样性，引进国外小麦种质具有等位变异丰富、遗传多样性高等特点，为丰富我国小麦种质资源、加快新品种培育进程做出了重要贡献（李小军等2009；王光禄等2016）。引进美国小麦种质抗性较好，遗传多样性较高，与国内种质遗传差异较大，可丰富我国小麦的遗传基础，为抗病育种奠定基础，但成熟期较晚、千粒重偏低、株高偏高（白玉路等2010；李艳丽等2013）。 2小麦-华山新麦草衍生后代分子细胞遗传学及其纹枯病抗性鉴定评价1.2小麦根茎部真菌病害小麦真菌病害，特别是小麦根茎部的真菌病害，近年来不断发展，严重威胁小麦产量及品质（Prangeetal.2005；Siudaetal.2010），主要有纹枯病、根腐病和全蚀病，在小麦的各生长时期均有发生。这三类病害在苗期不易区分，早期防治困难。1.2.1小麦纹枯病危害纹枯病的命名源于被浸染部（茎秆及叶鞘基部）的“眼”状病斑。植株被侵染后，病菌由基部向四周扩散，破坏植株的运输组织，进而阻碍营养物质的运输。严重时，甚至会出现枯孕（白）穗，损失多至产量2/5（WeiRong2016）。近年，纹枯病在我国近2/3省(市)不同程度发生，特别在苏、晥、豫、鲁、冀五省，纹枯病发生更为普遍、危害更为严重。2005年，810万hm2冬小麦受禾谷丝核菌影响（Mcbeathetal.2010）。2006-2015年，由纹枯病造成的实际年均小麦产量损失54.63万t，经济损失10亿元以上（刘万才等2016）。2017年，纹枯病总体偏重，发生面积866.67万hm2。（全国农业技术推广服务中心2017）真菌病害防治的根本手段是选育抗病品种并推广种植。发掘抗性基因，选育抗性品种，扩宽小麦遗传谱，对小麦抗病育种的有着重要意义。1.2.2小麦纹枯病抗病遗传研究历史最早的相关报道出现在1943年，但直到1977年，荷兰研究人员才分离出不同于R.solani的R.cerealis，经国内研究人员鉴定，小麦纹枯病主要由R.cerealis侵染引起（Glynneetal.1943；Groschetal.2007；Hollinsetal.1983；汪敏等2011）。小麦纹枯病的发现较晚，研究较慢，对其抗性的遗传分析也较少。一部分报道认为纹枯病抗性涉及主基因，如：刘朝晖等（1999）对不同杂交组合进行正反交，对比亲代、F1代和F2代抗病鉴定结果，推断纹枯病抗性可能由1.0-1.3对主基因和部分微效基因共同控制。张小村等（2004）以15个小麦RILs群体为对象，结果表明，纹枯病抗性可能受两对主基因和微效基因共同控制。吴纪中等（2005）等以（ARz×扬麦158）F6代RIL群体为对象，结果表明，纹枯病抗性遗传模型与B-2-1模型相符，2对主基因互作。任丽娟等（2010b）结果相近。此外，大多研究表明是纹枯抗性由数量抗性位点（QTLs）控制，易受环境影响。霍纳新等（2002）以F2代、（Opta85×W7985）RIL群体和（温麦6号×山红麦）RIL群体为研究对象，定位了9个QTLs，结果表明，纹枯病抗性由QTLs控制，其遗传机制在苗期和成株期不同，受环境影响大。汤颋等(2004)等和蔡士宾等(2006)均以（ARz×扬麦158）F6代RIL群体为对象，前者定位了6个QTLs，后者发现了11个与纹枯病抗性极显著相关的SSR标记，并定位了2个QTLs。颜伟等（2006）以（ARz×扬麦158）F9代RIL群体为对象，定位了9个QTLs。任丽娟等（2008）以（苏麦3号×白兔3号）F6代RIL群体为研究对象，定位了4个QTLs。陈江（2014）以（Luke×AQ）F8为对象群体，定位了7个QTL，结果表明，累积QTLs可增加纹枯抗性，不同QTL间以加性 第一章文献综述3作用为主，存在上位性互作，部分和环境互作，。蒋彦婕等（2014）以（Niavt14×徐州25）F6:8代RILs群体为研究对象，定位了3个主效QTL。综上，纹枯病抗性是一种涉及微效多基因的可遗传的数量抗性，基因之间存在加性互作，其作用强度因不同品种而异。1.2.3纹枯病抗性相关基因研究进展由于小麦基因组庞大复杂，且该病的表型鉴定困难，纹枯病抗性遗传研究仍在缓步前行（祝秀亮2013）。此外，从正向遗传学着手，先构建高代群体定位再分离纹枯病抗性基因相对耗时。部分研究人员开始从反向遗传学入手，并已分离了部分抗性相关的基因（表1-1）。表1-1纹枯病抗性相关基因的鉴定与分离Table1-1Theidentificationandisolationofresistancerelatedgenesaboutsharpeyespot基因名称基因家族研究者（年份）NameGenefamilyReacher(Year)姚乌兰等（2007）TiERFIaERFYaoetal.(2007)董娜（2008）TaPIMP1BYMDong.(2008)DQ-GLUPR-2刘宝业（2008）抗菌肽Rs-AFP2Liuetal.(2008)RaphnussativusantifungalproteinClassIRC7几丁质酶基因ClassIPR-3路妍等（2009）抗菌肽Rs-AFP2Luetal.(2009)RaphnussativusantifungalproteinTaPIEP1ERF周淼平等（2011）TaPIMP1BYMZhouetal.(2011)RS33ERF祝秀亮（2013）抗菌肽SN1Zhuetal.(2013)Raphnussativusantifungalprotein富含半胱氨酸的受体蛋白激酶TaCRK1CRK杨坤（2014）细胞壁关联的受体蛋白激酶Yangetal.(2014)TaWAK5WA,K洪彦涛（2014）TaMYB86BYMHong.(2014)TaCPK7CDPKs申芳嫡等（2015）OpIAP-p35Shenetal.(2015)罗美英等（2016）TaPK-R1AGCLuoetal.(2016)TaAGC1AGC祝秀亮（2016）TaRCR1CC-NB-LRRZhu.(2016) 4小麦-华山新麦草衍生后代分子细胞遗传学及其纹枯病抗性鉴定评价1.3小麦近缘种属植物的利用种质资源是作物选育和创制的物质基础，涵括地方品种、原始栽培类型、本地改良的品种、外地引进品种和野生近缘植物等。长久以来，常规育种作为主要的育种方式，组合的选择局限于主要品种，致使品种间遗传谱窄，需扩大选择范围、拓宽遗传谱。小麦的三级基因源（genepool-3）缺乏小麦基因组（龙丹2015）。同普通小麦相比，二者的亲缘关系远，它们的杂交后代不实、不育现象明显；对比一、二级基因源，有它们所缺乏的优异基因，是拓宽小麦遗传谱的重要宝库，可为小麦种质创新提供物质基础。1.3.1小麦远缘杂交一般指小麦近缘种属植物和普通小麦之间的杂交。通过远缘杂交，种(或科、属)间隔离打破，近缘种属植物的优良基因被转入普通小麦，扩大了其遗传变异和遗传基础。当前，应用比较广泛的有大麦属、黑麦属和偃麦草属等。1.3.2染色体工程育种通过定向改变目标材料的遗传基础，可以提高目标材料的产量、品质、抗病性和抗逆性等，加速远缘杂交育种进程。根据对同种（或异种）染色体（或片段）的操作手段不同，可分为以下四类：1.3.2.1染色体附加染色体附加指一条或多条与目标染色体组的种属相同或不同的染色体被导入目标染色体组。附加系可分为：单体、二体、部分双二倍体、完全双二倍体、三体和四体附加系。LeightyandTaylor(1924)发现首例附加系。O'Mara(1940)首次提出附加系的选育方法。上世纪80年代，普通小麦7182与华山新麦草的杂交工作才展开，经幼胚培养，获得了属间杂种H8911。在此基础上，经过多次回交、自交后，得到了一批单体和二体附加系（陈漱阳等1991，1996）。武军等（2007a）综合应用细胞学观察和GISH，选育出一批异附加系。Duetal.(2014)创制了一整套异附加系。Kangetal.(2009)将经由倍性育种得到的双二倍体和亲本回交，选育出高抗条锈的3Ns单体异附加系PW-11。1.3.2.2染色体代换染色体代换指目标物种的1条（或1对）同源（或部分同源）染色体被外缘染色体替代。根据被代换染色体的数目多少和片段大小，代换系可分为：单体、二体和染色体片段代换系。Katterman等最早发现自发的黑麦-小麦5A/5R代换系（穆素梅等，1996）。 第一章文献综述5普通小麦7182与华山新麦草杂交工作中，侯文胜等（1997）通过“缺体回交法”，选育了一批单体代换系，而后通过自交，获得5A/5Ns和3D/3Ns二体代换系。Duetal.(2015)综合运用GISH和分子标记分析法，鉴定出一份有着穗长、粒大、高抗条锈等优良性状的2Ns/2D异代换系16-6。1.3.2.3染色体易位染色体易位可以发生在1条染色体内，也可以发生在2条同源（或非同源）染色体间，是一种位置变动。Sears(1956)将小麦与（野生二粒小麦×伞穗山羊草）杂交，经过两年回交，获得一份抗叶锈的小麦-山羊草易位系。在陈漱阳等（1991）的研究基础上，井金学等（1999）选育出抗条锈的小麦-华山新麦草易位系H9020-17-5。此后，研究人员以H9020-17-5及其后代为对象，就抗锈基因展开了系列研究（曹张军等2005；Caoetal.2008；刘佩2008；Maetal.2013；姚强等2010）。Kangetal.（2016）在（PHW-SA×CN16）BC1F5群体中,分离鉴定出有着穗多、粒多、高抗条锈等优良性状的小片段易位系K-13-835-3。1.3.2.4染色体削减染色体消减的对象是染色体或染色体臂，削减后可分：单体（1条）、缺体（1对）和端体（1臂）。李振声等（1982）创立小麦蓝单体系统，并提出“缺体回交法”，大大缩短了异代换系、易位系的人工创制进程。1.3.3小麦近缘种属抗性大麦（HH,2n=14）属大麦属，具有耐盐碱、抗穗发芽、黄矮病等优良性状。迄今，已经在大麦中定位了一系列抗条锈病基因（YanandChen2006，2007；Lietal.2016）。Chenetal.（2013）对一批大麦地方种进行茎基腐病鉴定，筛选出高抗材料AWCS079，通过构建RILs定位了2个主效QTLs。楚单单等（2016年）利用土表法，筛选出9份纹枯病抗性较好的大麦品种。黑麦（RR,2n=14）属黑麦属，抗多种病害，如锈病、白粉、纹枯等。当前，已在1RS定位了多种抗病、虫害基因（Luetal.2010；Magoetal.2005；Singhetal.1990）。刘朝晖等（1999）对小麦近缘物种进行过纹枯病抗性鉴定，结果表明，黑麦中始终未见发病。中间偃麦草（JJJSJSStSt，2n=42）和长穗偃麦草（JJJJsJs,2n=70）属偃麦草属，抗叶锈、杆锈、条锈、白粉、纹枯、禾谷头孢条纹病和根腐病等真菌病害（李欣等2012；李洪杰等2013；Zhangetal.2011）。李洪杰等（2013）在对小麦-偃麦草后代进行纹枯病抗性鉴定的基础上，结合FISH结果，推测4Js和4J染色体上可能有纹枯病抗性位点。 6小麦-华山新麦草衍生后代分子细胞遗传学及其纹枯病抗性鉴定评价簇毛麦（VV，2n=14）属簇毛麦属，抗白粉、条锈、叶锈、秆锈、全蚀等多种小麦病害，是小麦遗传改良的优良基因源（Gradzielewska2006；刘畅等2017；尹军良等2015）。华山新麦草抗条锈、白粉、全蚀病等病害，是我国特有的濒危物种。白宇皓（2017）对51份小麦-华山新麦草衍生系进行纹枯病抗性鉴定，筛选出11份抗病材料。1.4小麦种质资源遗传的研究方法随着现代生物技术的迅速发展，对于种质资源遗传分析的方法更加多元化，分子生物学在育种工作中应用更为广泛，加快了育种进程，提高了定向改良的精度。1.4.1形态学标记作物表型受作物基因型与环境共同调控。一方面，通过直接观察亲代和子代的的农艺性状，可以确定子代个体中有无导入外源遗传物质；另一方面，通过对比不同物种，可以判断生物遗传变异的程度。位于4E染色体的蓝胚乳基因控制胚乳颜色，有剂量效应，可用于鉴别蓝粒小麦后代材料（李振声等1982；英加等2001）。该方法简单、快捷，但由于表型多为数量性状，易受环境影响，可靠性有限。曾潮武等（2017）对128份中亚引进春小麦的主要农艺性状进行调查，结果表明，这批材料的遗传多样性丰富。1.4.2细胞学标记细胞学标记指根尖体细胞或花粉母细胞的染色体被染色后，在光学显微镜下显示的核型或带型。在小麦中，C-带（着丝粒显带）的应用最为广泛，能显示与着丝粒紧邻的异染色质区，从而辨别异源染色体（或片段）。赵继新等（2003）对3个异代换系和2个附加系利用C-带区分，鉴明了它们的遗传组成。窦全文和陈佩度（2003）对陇青地区的5份圆锥小麦地方种利用C-带进行分析，结果表明，黑芒白麦和另4份遗传分化较远。1.4.3生物化学标记物种的特定基因能编码特定的蛋白。利用不同溶剂提取蛋白产物，经过电泳，能分离出不同蛋白。通过根据蛋白谱的改变鉴定外源遗传物质是否导入。可分为：1.4.3.1同工酶标记同工酶谱带与基因位点直接相关，通过电泳，染色，分析酶谱差异，能确定基因归属，进一步鉴定外源染色体导入有无，比较物种亲缘关系。该方法准确性高，受环境因素影响小，但由于同工酶的种类和数目有限，操作繁琐，实际应用少。刘芳等（1992）利用酯酶同工酶对华山新麦草的草属间杂种及其亲本进行分析，结果表明，亲本间的关系较远。1.4.3.2种子贮藏蛋白标记 第一章文献综述7该标记相对同工酶，不易受环境影响，相对稳定（周延清等2008）。物种不同，其种子的蛋白基因所编码的醇溶蛋白和麦谷蛋白不同，在电泳图谱上的数量、位置及排列顺序也有所差异，从而较精准分辨。在小麦-华山新麦草后代鉴定工作中，Zhaoetal.(2010)综合利用种子贮藏蛋白标记和GISH，鉴明了1Ns异附加系H9021-28-5。Kangetal.(2010)利用上述两种方式并结合C-带分析，鉴明了华山新麦草部分双二倍体PHW-SA。1.4.4原位杂交根据碱基互补配对原则，标记探针DNA与靶目标染色体杂交后，在染色体水平检测待测样中有无标记核酸（杨晓菲2016）。该方法灵敏性高、特异性强、快速省时，当前应用广泛的有：基因组原位杂交（GISH）和荧光原位杂交（FISH）等（汪慧等2011；杨国华等2002）。小麦-华山新麦草杂交后代的鉴定中，GISH和FISH也已得到广泛应用（Duetal.2014；2015）。1.4.5分子标记在基因水平上，以核苷酸序列变异为基础，检测基因组之间差异。分子标记不易受环境因素影响和物种自身变化（生育时期）的影响，保守性较好，供检测位点数量多，多态性好，大多为显性或共显性，能用于基因分型。1.4.5.1AFLP分子标记用限制酶对基因组DNA切割，连接特定接头，再用特异引物扩增，观测有无产物。该标记的可靠性、稳定性、多态性和重复性均较好，缺点是成本高。曹张军等（2005）利用AFLP标记，对（H9020-17-5×铭贤169）F2代群体进行分析，开发了与YrHua连锁的AFLP标记。袁璟亚等（2012）对PHW-SA及其亲本，利用AFLP标记进行分析，结果表明，Ns基因组在合成过程中遗传变异大。1.4.5.2SSR分子标记一般指1-6个核苷酸为重复单位串联的重复序列（方治伟和李论2018）。该标记为共显性，数量多、多态性好、易操作，应用广泛（张丹等2014）。武军等（2007b）利用SSR标记，对20个小麦-华山新麦草异附加系进行了分型。刘颖等（2015）利用SSR标记对34份纹枯病抗性材料进行分析，将其划为两大类，并发现2对与纹枯病抗性QTLs相连锁的SSR标记普遍存在。1.4.5.3EST分子标记EST是挑选cDNA文库中的拷贝，经测序，得到的两端序列。STS是可以将已知序列信息的单拷贝（200~500bp）扩增出来的特异引物（刘学军等2010）。EST序列保守 8小麦-华山新麦草衍生后代分子细胞遗传学及其纹枯病抗性鉴定评价性高，通用性在种属间高，适用外源遗传物质鉴定、比较基因组研究等。在小麦-华山新麦草后代鉴定中，该标记配合其他鉴定方法，被广泛应用（韩颜超等2015）。1.4.5.4SNP分子标记基因组水平上，单个核苷酸变异，导致基因编码序列和（或）氨基酸序列发生改变。该方法自动化水平高，适用大规模一次扫描，便于作图。小麦中，主要应用的有IlluminaiSelect90k和AffymetrixAxiom660k等（Cuietal.2017；Wangetal.2014）。李玉刚等（2018）综合利用SSR标记和90K芯片，构建了青农2的遗传图谱，分析了鲁麦14对其的遗传贡献。1.5本研究的目的、意义及内容1.5.1研究的目的和意义近年，由于气候变暖、氮肥施用增多、免耕的推广等原因，小麦纹枯病在我国大面积发生，导致小麦的株（穗）粒重下降，进而产量和品质下降，严重威胁我国粮食安全。小麦的野生近缘种属中存在普通小麦中缺乏的优良基因，是小麦遗传改良的重要宝库。华山新麦草中含多种抗病虫害基因，是优良的抗源材料。此外，国外引进材料中也有好的抗源。本研究以小麦-华山新麦草衍生后代、国内改良品种，引进美国小麦材料为研究对象，以期筛选出对纹枯病具有良好抗性的种质资源，为纹枯病抗性育种奠定基础。并对小麦-华山新麦草衍生后代进行细胞学观察和基因组原位杂交（GISH）和分子标记（SSR和EST-STS）分析，明确衍生后代染色体构型和外源染色体定位，为挖掘和利用华山新麦草优异基因奠定基础。1.5.2本研究的内容1.对59份小麦-华山新麦草衍生后代材料进行细胞遗传学鉴定，明确小麦-华山新麦草衍生后代染色体构型和外源染色体定位。2.对59份小麦-华山新麦草衍生后和97份引进美国小麦材料和国内改良品种进行纹枯病抗性筛选鉴定和田间农艺性状调查。3.对纹枯病抗性较好的材料利用分子标记进行遗传多样性分析和抗性位点标记验证，利用分子标记结合农艺性状进一步明确其遗传组成。研究技术路线如下：有明显外源信号分田间农艺性状调查纹枯病抗性鉴定分子标记分析细胞学鉴定子原标位记杂鉴交无明显外源信号 第二章小麦-华山新麦草衍生后代的鉴定9第二章小麦-华山新麦草衍生后代的鉴定近年来，小麦相对窄的遗传变异已成为阻碍小麦产量的首要因素(Mujeeb-Kazietal.2013)。小麦的野生亲缘植物中蕴藏多种病虫害抗性基因，通过远缘杂交和染色体工程育种技术，将外源基因导入普通小麦，拓宽小麦遗传变异，进而改良栽培种。应用比较广泛的有黑麦（1RS）、长穗偃麦草（7E）、簇毛麦（6VS）和冰草（6P）等（Wuetal.2006）。本课题组自上世纪80年代开始进行普通小麦与华山新麦草的杂交工作，获得了一批衍生系。在此基础上，傅杰等（2003）、武军等（2007a）、赵继新等（2010）和杜万里等（2014）创制了一系列异附加系和异代换系。本试验以课题组近期创制的59份小麦-华山新麦衍生后代为材料，利用细胞学观察和GISH、SSR和EST-STS等方法分析其染色体构型和和外源染色体定位，为小麦染色体工程育种提供桥梁材料，对充分利用华山新麦草优异基因奠定基础。2.1材料和方法2.1.1试验材料华山新麦草(PsathyrostachyshuashanicaKeng；2n=14,NsNs)、普通小麦7182(2n=42,AABBDD)、59份小麦-华山新麦衍生后代材料，这些材料均由我们陕西省植物遗传工程育种重点实验室创制和保存。表2-1试验材料Table2-1Materialsforexperiment编号材料编号材料编号材料编号材料编号材料No.MaterialNo.MaterialNo.MaterialNo.MaterialNo.Material109-18-1-11309-40-3-1-1-125Y-10737Y-157-149Y-76-2209-20-10-11409-43-17-1-1-126Y-114-138Y-55-250Y-78-1309-21-10-2-11509-44-5-1-1-127Y-114-239Y-57-151Y-78-2409-21-10-3-1-11609-45-14-1-128Y-114-340Y-58-152Y-83-1509-30-1-2-11718-1-3-1-6-2-229Y-11741Y-60-153Y-83-2609-33-8-1-118H-6-11-130Y-12542Y-69-154Y-83-3709-33-12-1-119H-19-10-2-131Y-12643Y-69-255Y-88809-35-13-1-120H-3-1-1-132Y-13944Y-7156Y-97-1909-36-1-1-121H-14-11-1选133Y-14345Y-73-157Y-97-21009-38-7-1-122H-1-8-1-3-134Y-14646Y-73-258Y-97-31109-39-3-1-2-123Y-105-135Y-14847Y-7559Y-981209-39-3-1-2-224Y-105-236Y-15048Y-76-1 10小麦-华山新麦草衍生后代分子细胞遗传学及其纹枯病抗性鉴定评价2.1.2试验方法2.1.2.1根尖材料的制备对供试材料种子用70%酒精消毒处理2~3min，清水冲洗后，腹沟朝下摆，放在铺有滤纸的培养皿内，并添加适量水。次日，种子露白后，将多余的水倒出，并用滤纸吸干残留的水，将培养皿转移到冰箱（4℃）。第二日下午4点取出，再转移到置物柜，常温培养至生出3条根。用消毒镊子取根尖于清水中，4℃保存24h后，转入卡诺氏固定液（CH3COOH：CH3CH2OH=1：3，V/V），-20℃存放。2.1.2.2染色体形态观察45%醋酸洋红处理根尖，制备压片，OlympusBX60显微镜观察，PhotometricsSenSysCCD拍照存档。2.1.2.3基因组原位杂交将制备好的压片揭片，室温存放。参照Dig-Nick-TranslationMix(Roche,Germany)说明书，对华山新麦草的全基因组DNA进行标记。GISH步骤参照Hanetal.(2004)。1.烘片：烘箱中进行，37~50℃，2~3h。2.探针标记：参照说明书标记后，15℃水浴1~1.5h，加入微量EDTA缓冲液，65℃水浴8~10min后，不透光保存在4℃或-20℃。3.洗片：依次用2×SSC（37℃）、2×SSC（室温25℃）、70%CH3NO（75℃）、70%、90%和100%CH3CH2OH清洗，前两种试剂各3min,后三种试剂各5min后，70%CH3NO10~30s。而后取出制片，自然晾干。4.杂交液配制：每张制片为20μL体系，包含CH3NO（去离子）10μL、50%(W/V)DS4μL、20×SSC2μL、10%SDS0.5μL、ssDNA（5μg·μL-1）0.5μL和探针DNA100ng,加ddH20配平。沸水浴8~10min后，立即转至冰上，放置20min以上。5.变性与杂交：待所有制片晾干，将配好的杂交液滴加到制片上，转入不透光湿盒后，整体移至烘箱（80℃），8~10min后取出，放入恒温箱过夜(37℃，16~24h)。6.杂交后洗脱：将湿盒中的制片取出，依次用2×SSC、10%CH3NO、0.5×SSC、0.5×SSC和2×SSC清洗（32℃），再用4×SSC清洗（室温25℃），除10%CH3NO清洗时间为15s外，其余均为3min。7.加抗体：每张制片滴加90~100μL5%BSA后，加盖玻片，转入恒温箱（37℃），20~25min）。配制BSA和抗体的混液，滴加在取出的制片上（50μL/张），加盖玻片，放入恒温箱（37℃，1h）。 第二章小麦-华山新麦草衍生后代的鉴定118.染色和观察：将制片取出，依次用4×SSC（37℃）和4×SSC（室温25℃）清洗，各洗4min。晾干后，滴加PI和H-1300的混液，于30min后观察并拍照存档。2.1.2.4SSR和EST-STS分析利用Röderetal.(1998)、Pestsovaletal.(2000)等开发的SSR和EST标记进行分析。PCR反应体系按照常规方法。10μL体系：模板和引物各1μL，Mix5μL，灭菌去离子水3μL。94℃预变性3min，94℃变性1min，退火45s（Tm值参照具体引物），72℃延伸lmin，35个循环，72℃延伸l0min，4℃结束反应。采用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（上样量4μL，165V，2~3h），而后固定、染色各10min，显色后立即拍照存档。2.2结果与分析2.2.1细胞学鉴定59份小麦-华山新麦衍生后代的根尖体细胞进行镜检，其染色体数目均为2n=42条。以华山新麦草基因组DNA为探针，对这59份材料根尖体细胞有丝分裂中期染色体进行了GISH鉴定，结果显示材料18-1-3-1-6-2-2中检测到2条带有完整黄绿色信号的染色体，其余40条染色体为红色，推测18-1-3-1-6-2-2含有2条源自华山新草的染色体（图2-1）。其余材料，未检测到明显黄绿色信号，考虑这部分材料的农艺性状与亲本存在差异，这部分材料有可能导入了华山新麦草小片段染色体（图2-2）。图2-118-1-3-1-6-2-2的根尖细胞观察及其原位杂交Fig.2-1Therootcellsof18-1-3-1-6-2-2atmitosismetaphase(A)anditsGISHanalysis(B) 12小麦-华山新麦草衍生后代分子细胞遗传学及其纹枯病抗性鉴定评价图2-2Y-83-1的根尖细胞观察及其原位杂交Fig.2-2TherootcellofY-83-1atmitosismetaphase(A)anditsGISHanalysis(B)2.2.218-1-3-1-6-2-2的SSR分析利用分布于小麦全基因组的特异SSR引物对18-1-3-1-6-2-2进行分析，结果显示，除分布于2D染色体上的所有引物，均能在18-1-3-1-6-2-2和普通小麦品种7182中扩增出目标条带，而3对2D染色体上的引物（Xgwm261,Xgwm539,Xgwm157），只能在7182中扩增出目标条带，却不能在18-1-3-1-6-2-2中扩增出预期条带，说明18-1-3-1-6-2-2可能缺失了2D染色体（图2-3）。图2-318-1-3-1-6-2-2的SSR分子标记结果M：DL2000；1：华山新麦草；2：7182；3：18-1-3-1-6-2-2。箭头指示目标条带。Fig.2-3SSRmarkersanalysisfor18-1-3-1-6-2-2.M:DL2000DNAMarker,1:P.huashanicaKeng,2:Triticumaestivum7182,3:18-1-3-1-6-2-2.Thearrowsindicatesthetargetbands. 第二章小麦-华山新麦草衍生后代的鉴定132.2.318-1-3-1-6-2-2的EST-STS分析利用85对EST-STS引物对18-1-3-1-6-2-2进行分析，结果显示，除分布于第2同源群的特异EST-STS引物，都能在18-1-3-1-6-2-2及其两亲本中均扩增出目标条带；而分布在第2同源群上的3对EST-STS引物（BQ159450,BQ160526,BE404332）在华山新麦草和18-1-3-1-6-2-2中均扩增出7182中缺乏的特异条带，推测18-1-3-1-6-2-2中可能有源自华山新麦草的2Ns染色体。结合2.2.2中的结论，推断18-1-3-1-6-2-2为小麦-华山新麦草2Ns(2D)异代换系(图3-3)。图2-318-1-3-1-6-2-2的EST-STS分子标记结果M：DL2000；1：华山新麦草；2：7182；3：18-1-3-1-6-2-2。箭头指示目标条带。Fig.2-3EST-STSmarkersanalysisfor18-1-3-1-6-2-2.M:DL2000DNAMarker;1:P.huashanicaKeng;2:Triticumaestivum7182;3:18-1-3-1-6-2-2.Thearrowsindicatesthetargetbands.2.3讨论小麦野生近缘种属中有很多优良基因，可被用来提高小麦的产量、品质和对生物及非生物胁迫的抗性（Luetal.2016）。常规方法是在异附加系和异代换系创制的基础上，选育易位系，特别是小片段易位系。被导入目标基因组的外源遗传物质数目越少，连锁累赘越少，减数分裂行为越规律，越容易被直接利用(Kangetal.2016)。近年来，鉴于华山新麦草的优良性状，国内外研究人员展开了一系列研究(杜亚楠等2010；Kangetal.2008，2009；Kishiietal.2010)。特别是2Ns基因组，研究认为2Ns上有控制单穗小花数、单穗粒数、分蘖数、穗长增加等性状的基因，可以提高小麦产量（Duetal.2014；2015）。此外，条锈病鉴定结果显示，小麦-华山新麦二体异附加系3-6-4-1和2Ns/2D二体异代换系16-6都表现高抗，推测2Ns染色体可能含抗条锈相关基因。刘洋 14小麦-华山新麦草衍生后代分子细胞遗传学及其纹枯病抗性鉴定评价等（2017）对小麦-滨麦2D/2Ns异代换系DM2411进行田间调查，结果表明，该植株株高显著低于亲本，推测2Ns染色体上可能含矮秆基因。本研究通过对59份小麦-华山新麦草衍生后代进行分子细胞学分析，鉴定出一份2D/2Ns异代换系18-1-3-1-6-2-2和58份含小片段华山新麦草染色体的衍生后代材料，需进一步明确其遗传组成，从而运用于小麦育种。 第三章小麦种质资源对纹枯病抗性鉴定与评价15第三章小麦种质资源对纹枯病抗性鉴定与评价小麦纹枯病是我国小麦主产区的主要土传病害，主要由R.cerealis侵染引起，部分由R.solani侵染引起（Chenetal.2013；Guoetal.2012）。病菌侵染宿主后，经由小麦的茎、叶鞘，破坏维管束和导管，造成小麦产量降低及粮食安全问题（陈建华等2011；刘雪梅和肖建国1999）。当前，生产上主要应用井冈霉素和三唑类杀菌剂（戊唑醇、丙环唑等）进行化学防治（徐建强等2018）。然而，杀菌剂的残留对环境和作物均有害，最安全有效的方法是培育抗病品种并推广种植。种质资源鉴定和筛选是选育抗病品种的基础。近年来，国内外报道了数千份小麦种质资源的纹枯病抗性鉴定结果（蔡士宾等2006；Cromeyetal.2012）。其中，对纹枯病抗性较好的国内改良品种有西农9871、丽麦16等，农家品种有红蛐子、山红麦等，国外引进品种有FHB143、ARz和CI12633等（蒋彦婕等2013；Wuetal.2017）。小麦近缘种属植物也是好的纹枯病抗性资源库（李洪杰等2013；袁虹霞等1998）。然而，目前我国生产上推广利用的小麦尚无高抗或免疫品种，且多为高感纹枯病，需要拓宽鉴定材料范围，如小麦近缘种属和国外引进材料等（魏学宁等2015）。纹枯病新抗源的发掘工作尚需继续进行。本试验以156份小麦材料为研究对象，包括42份国内改良品种，55份引进美国小麦材料和59份小麦-华山新麦草后代，利用纹枯病温室牙签接种法进行纹枯病抗性鉴定，结合田间农艺性状调查，筛选出纹枯病新抗源。3.1试验材料156份小麦材料，包括42份国内改良品种，55份美国小麦材料和59份小麦-华山新麦草后代材料，以扬麦158作为感病对照。这些材料均由陕西省植物遗传工程育种重点实验室创制和保存。小麦纹枯病菌种为强致病力菌株R0301，由江苏省农业科学院提供。3.2试验方法3.2.1病菌接种采用牙签法于温室进行接种。2015年对156份小麦材料进行了纹枯病抗性初步鉴定；2016年、2017年分别对筛选出的抗性较好的材料进一步鉴定。具体操作步骤为，将种子30d春化处理后种植于温室，每份小麦材料种3盆,每盆15株,在苗期(一般4~5叶期)接种,30d后调查发病情况。带菌牙签的准备：将牙签的两端(长约1.5cm)于烧杯中浸泡24h后，取出灭菌，无菌操作移入接种R0301的PDA培养基上。25℃恒温培养2~3周后，放于4℃备用。苗期接种：用无菌镊子夹取，小心嵌入叶鞘（1:1），接 16小麦-华山新麦草衍生后代分子细胞遗传学及其纹枯病抗性鉴定评价种处缠绕湿润的医用脱脂棉。每盆接种10个单株。接种后喷雾保湿48h，之后常规管理，每天喷水一次。3.2.2病情调查与评价接种后30d（通常为小麦乳熟期）调查小麦纹枯病温室发病情况，病级及评价参考任丽娟等（2016）提出的方法，略有改动。并根据下面的公式计算病情指数。病情指数（DI）=（0×X0+1×X1+2×X2+3×X3+4×X4+5×X5）/(X0+X1+X2+X3+X4+X5)×5×100%，式中0、1、...5表示病害等级，X0、X1、…、X5表示和病害等级对应的植株数。DI=0为免疫，0