srbsdv 12个基因植物表达载体构建及转基因水稻表型初探

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1、学校代码：10564学号：2013202117分类号：S432.1密级：硕士学位论文SRBSDV12个基因植物表达载体构建及转基因水稻表型初探吕卡伦指导教师：周国辉教授学院名称：农学院专业名称：植物病理学答辩委员会主席：何自福研究员中国·广州2016年6月摘要南方水稻黑条矮缩病毒（Southernriceblack-streakeddwarfvirus,SRBSDV），是呼肠孤病毒科（Reoviradae）斐济病毒属（Fijivirus）的一个暂定新种。该病毒侵染水稻后病株表现矮缩，叶色深绿，叶片基部产生皱褶，茎节部有倒

2、生须根及茎表瘤突、高节位分蘖及根系褐化。前人研究发现SRBSDV全基因组由10条线性dsRNA组成，根据各片段从大到小分别命名为S1~S10，其中S5、S7和S9分别编码两个蛋白其余各片段均编码一个蛋白。目前，SRBSDV部分基因功能及其致病机理尚未清晰，尤其是病毒蛋白与寄主水稻之间的互作机制方面仍需要更深入的探索。为研究SRBSDV各基因所编码蛋白的功能和致病机理，本研究分别构建了SRBSDV12个基因的植物表达载体。利用农杆菌介导法，分别获得由SRBSDVS1和S10编码的RdRP和CP转水稻植株，并重点对T1代转基

3、因水稻的表型进行观察和利用RT-qPCR技术检测CP的相对表达量。取得如下研究结果：1.克隆了SRBSDV12个编码基因，构建了12个基因的植物表达载体，并获得了相应的工程农杆菌。通过RT-PCR，以SRBSDV感病水稻叶组织总RNA为模板，扩增获得了病毒S1、S3、S4、S5-1、S5-2、S6、S7-1、S7-2、S8、S9-1、S9-2和S10编码的共12个基因，经测序确认后连接到植物表达载体pCambia1302上，获得各基因的植物表达重组质粒，分别命名为pC1302-P1、pC1302-P3、pC1302-P4

4、、pC1302-P51、pC1302-P52、pC1302-P6、pC1302-P71、pC1302-P72、pC1302-P8、pC1302-P91、pC1302-P92和pC1302-P10，利用电激法将上述重组质粒成功转化到农杆菌EHA105菌株中。2.分别获得了4株转RdRP和6株转CP的水稻植株。以水稻品种“日本晴”胚性愈伤组织为受体，用携带植物表达重组质粒pC1302-P1和pC1302-P10的农杆菌EHA105侵染愈伤组织，经过潮霉素抗性筛选，预分化和分化，生根炼苗等过程分别获得4株P1阳性和6株P10阳

5、性植株，Southernblot检测外源基因S10均为单拷贝。3.对T1代P1转基因水稻植株的表型进行观察发现，各株系T1代群体幼苗期时与非转基因水稻表型没有明显差异。分蘖期时，部分转基因水稻植株表现出白化现象。白化植株的心叶表现正常，但其余叶片均有不同程度的白化，且长势I较弱。4.获得了T1代P10转基因水稻植株，并对其进行了分子检测和表型观察。对T1代P10转基因水稻植株进行PCR检测，结果表明，6个株系的外源基因基本均以3:1的比例进行遗传分离，符合孟德尔单基因遗传规律。T1代P10转基因植株幼苗期时与非转基因植株

6、没有明显的表型差异。分蘖期时，部分转基因植株长势明显减弱，表现出矮化，分蘖减少等表型。5．建立了转基因水稻病毒CP相对表达量RT-qPCR检测技术。利用RT-qPCR技术，分别在幼苗期、分蘖期和抽穗期对转基因水稻植株的病毒CP的相对表达量进行了检测，结果表明，外源基因在转基因水稻三个时期均能成功转录。这些结果为进一步研究病毒P1和P10两个基因在SRBSDV侵染水稻过程中的致病机制提供了材料基础。关键词：南方水稻黑条矮缩病毒；植物表达载体构建；RdRP；CP；遗传转化IIConstructionofRecombinant

7、PlantExpressionPlasmidsContainingSRBSDV12GenesandPhenotypeAnalysisofTransgenicRiceLvKalun（CollegeofAgriculture,SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou510642,China）Abstract:Southernriceblack-streakeddwarfvirus(SRBSDV)isanovelandtentativespeciesbelongingtoFijivi

8、rus,Reoviradae.ThericeinfectedbySRBSDVshowsdwarfism,darkgreenleaves,foldedneartheleafbase,anatropousfibrilintheinternodesandtumorsinthestemwithhightilleringpos