cry1ab蛋白构效关系及小菜蛾中肠cry1ab1非受体结合蛋白研究

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1、学校代码：10385分类号：研究生学号：(1300507058)密级：Cry1Ab蛋白构效关系及小菜蛾中肠Cry1Ab1非受体结合蛋白研究Thestudyofstructure-functionrelationshipofCry1AbproteinandCry1Ab1-bindingnonreceptorproteinsfromPlutellaxylostella作者姓名：U刘肖萍指导教师：U林毅教授合作教师：U学科：U生物化学与分子生物学研究方向：U蛋白质工程所在学院：U化工学院论文提交日期：二零一六年六月七日学位证京；轴创性舌巧本人声巧齿互弦巧学化论丈是

2、本人在导师巧半下完成巧Ｗ宾成果。巧丈写巧中不扭含共化人。巧义表或巧写过的研奋内玄，如参考化人或其译的抖巧成果巧江比义中Ｗ■巧确巧方式化巧ｈ，本掉法丰有扣承化由此也史所产生的杖利扛责妊，ｊＩＩ记丈巧者里名：革名日期：之＾山刮韦子甲Ｉ爭位蛇女版巧巧巧授权黃巧本人巧患校权毕诉太学有枝化留并向国家机关或机辑送义争化论丈巧長印件和电子化允许甲化记丈话查巧和咕巧。本人巧，ｋ毕佈大学可Ｗ排本宇化帝文巧全却内忠或部分内容％九有关我巧库进行粒索ｔ可Ｗ表巧杉印、縮印或扫化等襄刺手设巧存和汇編本学佐记义。记文巧者爸若；化导拉师接

3、名：某啤在名曰期－：立ｏ＇ｆｃ由玉芒《曰期：之＂—Ｉ：摘要摘要苏云金芽胞杆菌（Bacillusthuringiensis，Bt）是目前世界上应用广泛、不污染环境的杀虫微生物，其杀虫活性主要源于芽胞形成过程中产生的杀虫晶体蛋白（InsecticidalCrystalProteins，Cry）。害虫抗性发展和一些重要害虫仍缺乏相应有效的Cry蛋白，是制约Bt及其Cry蛋白长期应用的两大难题。为此，本研究以Cry1Ab蛋白和小菜蛾为研究对象，一方面探讨Cry1Ab蛋白的结构与活性间关系，另一方面探讨害虫中肠中可结合Cry1Ab1的非受体蛋白。主要研

4、究结果如下：（1）系统解析了34个Cry1Ab蛋白的活性区空间结构，详细分析了其空间结构差异。基于活性区二级结构的差异将其分为四大类，其中Cry1Ab2、Cry1Ab7和Cry1Ab28分别为Cry1AbⅡ、Cry1AbⅢ和Cry1AbⅣ，其他成员都归属Cry1AbⅠ。Cry1Ab1（Cry1AbⅠ，只对鳞翅目有效）与Cry1Ab7（Cry1AbⅢ，对鳞翅目和双翅目均有效）的活性区存在4个氨基酸差异：A450P、F537L、P545I、T568I，其中只有A450P导致空间结构上的差异，该差异位于氨基酸447-449位，前者此处为β折叠，后者为loop。第450

5、位氨基酸位于DomainⅡ的loop3上，推测与受体结合相关。其他三个差异氨基酸分别位于DomainⅢ的β17、β18和β20上，可能和引导受体与Cry蛋白结合或稳定结构有关。（2）通过定点突变与杀虫活性测定，探讨Cry1Ab1与Cry1Ab7空间结构差异与其杀虫活性之间的关系。在结构解析的基础上，对Cry1Ab1蛋白450位氨基酸进行突变。在1μg/g和128μg/g浓度下，Cry1Ab1蛋白对小菜蛾的校正死亡率分别为61.2%和78.9%，而突变体A450P分别为45.6%和58.9%，活性有所下降，表明loop3的结构对Cry蛋白的杀虫活性具有重要作用；突

6、变体A450G分别为34.5%和55.6%，活性下降明显，表明氨基酸的侧链基团影响了Cry蛋白的杀虫活性。在浓度为50μg/mL下，突变体A450P无法杀死埃及伊蚊，表明loop3上的特异性结构不足以决定Cry1Ab7的杀埃及伊蚊活性，有必要进一步考察另外三个差异氨基酸对其杀埃及伊蚊活性的相关性。（3）通过Cry-受体分子对接研究，探讨Cry1Ab1和Cry1Ab7的差异结构在Cry与受体的结合上有何不同，进而解释其活性差异。Cry1Ab1和Cry1Ab7分别与小菜蛾APN受体的对接结果表明，二者的差异结构均参与了与APN的I华侨大学硕士学位论文对接，但参与对接

7、的氨基酸位点有所不同，这可能是导致突变体A450P相对于Cry1Ab1杀小菜蛾活性较低的原因。Cry1Ab1和Cry1Ab7分别与埃及伊蚊上的受体APN和ALP对接发现，二者的差异结构并未参与对接，且Cry1Ab1的DomainⅡ与受体不存在相互作用，推测这是Cry1Ab1及其突变体A450P对埃及伊蚊没有活性的原因。（4）率先探讨害虫中肠Cry非受体结合蛋白。将分离纯化的Cry1Ab1活性蛋白与层析介质Sepharose共价交联，从小菜蛾中肠（含肠腔液）水溶性提取物中，分离出潜在的可与Cry1Ab1结合的非受体蛋白，其中5个经LC-MS/MS鉴定为微管蛋白，谷

8、胱甘肽合成酶，ATP合成