基于g-四链体dnazyme的电化学dna传感器研究

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1、分类号密级硕士学位论文题目：基于G-四链体DNAzyme的电化学DNA传感器研究英文并列题目：StudiesonelectrochemicalDNAbiosensorsbasedonG-quadruplexDNAzyme研究生：王淑玲专业：生物化学与分子生物学研究方向：生物大分子的结构、功能与制备导师：周楠迪教授指导小组成员：田亚平教授学位授予日期：二○一六年六月二十日答辩委员会主席：吴敬江南大学地址：无锡市蠡湖大道1800号二○一六年六月摘要摘要对特定DNA序列的痕量检测在临床诊断、基因治疗、疾病预防、法医鉴定等领域有广泛的应用，吸引了众多学者的研究关注。对比传统的DNA检测

2、技术，电化学DNA传感器因成本低廉、操作简单、灵敏度高、特异性强、易于微型化等优点，在DNA检测方面展现出良好的应用价值。G-四链体是由富含G碱基的核酸序列形成的四链螺旋结构，G-四链体序列与血红素(hemin)结合后具有过氧化物酶活性，是一种人工酶。G-四链体-heminDNAzyme作为一种信号放大标记被广泛应用到多种电化学传感器的构建中。本论文构建了两种基于G-四链体-hemin复合物信号放大策略的电化学DNA传感器。主要内容如下：首先，构建了一种基于G-四链体催化信号放大的对双目标DNA检测的电化学传感器。设计了一段模板DNA序列(Tem-DNA)，其能与待检测的目标D

3、NA1(T1)和目标DNA2(T2)完全互补配对，并且能和一段形成G-四链体结构的信号DNA序列(Sig-DNA)部分互补配对。在T1、T2和信号DNA存在时，这些序列和模板DNA发生杂交反应并在E.coliDNA连接酶催化作用下形成一条DNA长链。经过热处理，杂交长链会与模板DNA彼此分离，并与固定在金电极表面的捕获探针发生杂交反应而被捕获。在hemin存在时，被捕获的长链中的信号DNA发生折叠和hemin形成G-四链体-hemin复合物，在电极表面产生很强的电信号。利用差分脉冲伏安法能实现对双目标DNA的高灵敏同时检测，该方法对T1和T2目标序列检测限分别是100fM和7.

4、4fM。通过用单碱基突变和三碱基突变序列取代目标序列结果比较证明该DNA传感器有良好的特异性。其次，将纳米材料技术和G-四链体-hemin催化信号放大技术结合起来构建了一种基于ExoIII辅助信号双重放大的简单、无标记、超灵敏的DNA电化学检测方法。设计了两种特殊的发夹型探针P1(I区含有形成G四链体结构的核酸序列，II区是目标DNA的互补序列，III区和I区为互补序列)和P2(IV区能和P1探针的3’端序列杂交被VI区杂交封闭，V区含有和目标序列相同的碱基排列可作为次级目标物取代目标DNA)。首先，用1,6-己二硫醇(HDT)将金纳米颗粒(AuNPs)修饰至金电极，制备了Au

5、NPs-HDT-Au电极，然后将P1探针修饰到电极上。在没有目标DNA存在时，P1和P2探针能够共存。在目标DNA、P2探针和核酸外切酶III(ExoIII)存在时，目标DNA能触发两个独立的反应循环：目标DNA和P1的杂交反应以及P2置换目标DNA与P1发生杂交反应形成P1-P2杂交双链；P1-P2链在ExoIII的识别催化作用下P2探针释放再次进入下一轮循环。ExoIII能识别P1和P2的杂交链，并催化切割反应至电极表面仅保留P1的G四链体形成区域(I区)。最后在hemin存在时，保留在电极表面的P1探针的G-四链体序列和hemin相互作用，产生很强的电信号。用差分脉冲伏安

6、法(DPV)对目标DNA进行检测，检测限达到3.98fM。关键词：电化学DNA传感器；G-四链体；差分脉冲伏安法；E.coliDNA连接酶；核酸外切酶IIIIAbstractAbstractDetectionoftracesequence-specificDNAhasshownsignificantapplicationsinthefieldofclinicdiagnosis,genetherapy,sicknesspreventionandforensicinvestigationsandattractedsubstantialresearchefforts.Compared

7、withtraditionalmethods,electrochemicalDNAsensorshaveshownpotentialapplicationsowingtotheirrelativelylowcost,simplicity,highsensitivity,highspecifityandeasetominiaturization.Guanine-richnucleicacidsequencecanfoldintoguaninequadruplexstructure(G-quad