基于g-四链体探针和链置换放大光学的分析新方法

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1、NovelMethodsofOpticalAnalysisBasedonG—quadruplexprobeandStrandDisplacementAmplificationbyZHOUHuiB．S．(HunanUniversity)2009AdissertationsubmittedinpartialsatisfactionoftherequirementsforthedegreeofDoctorofScience1nAnalyticalChemistrytheGraduateSchoolofHunanUniversitySupervisorProfes

2、sorSHENGuoliNovember，2012湖南大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。储虢J媳．日期：易。l五年f。月?Ft学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权湖南大学

3、可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于i、保密口，在年解密后适用本授权书。2、不保密口。(请在以上相应方框内打“√”)作者签名：翩獬：泗吁日期：2012年t]-yj弓日日期：2012年f加j日博士学位论文摘要核酸是一种广泛存在于生物体内的生物大分子，为生命的最基本物质之一。伴随着体外合成技术，特别是固相合成的出现，它已成为一种重要的分子工具，在生化分析领域扮演着重要的角色。由于核酸具有易于合成、稳定性好、生物相容性好、设计简单、信号机制灵活等诸多优势，它被广泛应用于分子

4、探针、分子机器、生物传感器的构建，另外它可与各种工具酶联用开发高效快速的信号放大方法。目前，基于核酸的分子探针和放大方法已成为构建光化学生物传感器的重要元件。这类传感器具有灵敏度高、操作简便、分析速度快、检测成本低、易于实现高通量和微型化等优点，在生物化学、生物医学、环境监测、食品、医药和军事等领域有着极其广阔的应用前景。新型多功能核酸探针的开发及高效信号放大方法的设计对发展多功能、高灵敏的光学生物传感器至关重要。基于以上考虑，综合文献报道，本文主要在开发新型多功能核酸探针和解决当前链置换放大方法在使用过程中存在的焦点和难点问题做了一些工作，主要内容如下：

5、鉴于含连续不问断富G片段的DNA探针具有优越的自组装性能已在生物材料领域引起广泛关注，而在生物传感器领域的报道相对较少，在第2章中，我们以一条含7个连续G碱基(G7s)的富G荧光探针为模型，对该类富G探针的自组装性能和荧光光学性质进行了详细研究。通过圆二色谱(CD)、紫外光谱(UV)和电泳分析发现该富G探针主要自组装形成分子间平行G．四链体结构(intermolecularparallelG．quadruplex，IGQ)。伴随这种独特的自组装行为，该探针展现出了独特的荧光猝灭机理，荧光背景非常低，并且猝灭信号可以通过加入互补序列进行调控。荧光信号恢复可达

6、近90倍，可与传统的分子信标媲美。实验结果表明该类IGQ信号探针在光学传感器领域具有良好的应用前景。第3章我们将IGQ信号探针与无标记的发夹探针结合，开发了一种新的无猝灭标记的分子信标(IGQ．MB)，应用于人P53基因检测。得益于IGQ信号探针独特的光学性质，我们实现了MB的识别序列与信号报告基团的分离。因此，针对不同的目标，我们只需根据需求重新合成无标记的发夹序列，从而大大降低了MB的实际操作成本，增强了通用性。另外，发夹探针末端的无标记有利于其在聚合反应以及界面分析方法中的应用，拓宽了MB的适用范围。G．四链体结构的引入使得该设计在疾病诊断和药物运载

7、领域具有更广阔的前景。在采用荧光嵌入剂作为信号报告基团的链置换放大(SDA)反应体系中，不依赖模板／引物的非特异性扩增现象广泛存在，并严重严重影响检测体系的背景信号。在第4章中，我们发现向体系中加入一种蛋白质能有效地抑制这种非特异性lI基于G一四链体探针和链置换放大的光学分析新方法扩增。基于该发现我们进一步提出了一种新的SDA模型一一切刻反转式SDA模型。该模型主要基于一条一体化的模板探针，告别了传统方法使用多条引物探针和循环高温加热操作的模式，不仅操作简单价格低廉，而且适用于37。C条件下DNA及蛋白质的无标记检测。第5章我们通过实验指出并证明了在传统的

8、采用目标识别和信号传导相分离的链置换扩增放大检测方法中，存在“信号