基于定量多色荧光原位杂交技术的卵巢癌多基因拷贝数异常的研究

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1、分类号：R392.11学校代码：10062密级：学号：2012601002博士学位论文DOCTORALDISSERTATION论文题目:基于定量多色荧光原位杂交技术的卵巢癌多基因拷贝数异常的研究TITLEQuantitativesinglecellanalysisonmulti-genecopynumbervariationinovariancancer一级学科：基础医学二级学科：免疫学论文作者：黄宇婷指导教师：姚智教授天津医科大学研究生院二〇一五年五月分类号：R392.11学校代码：10062密级：学号：2012601002学位类别：科学学位专业学位学科门类：医学博士学位论文

2、DOCTORALDISSERTATION论文题目:基于定量多色荧光原位杂交技术的卵巢癌多基因拷贝数异常的研究TITLEQuantitativesinglecellanalysisonmulti-genecopynumbervariationinovariancancer一级学科：基础医学二级学科：免疫学论文作者：黄宇婷指导教师：姚智教授天津医科大学研究生院二〇一五年五月学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同

3、志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文，并编入有关数据库。保密，在年解密后适用本授权书。本论文属于不保密。（请在相对应的方框内打“√”）学位论文作者签名：日期：年月日导师签名：日期：年月日天津医科大学博士学位论文中文摘要卵巢癌死亡率高居妇科肿瘤的首位，治疗策略为肿瘤减灭手术联合以铂类药物为

4、基础的化学治疗。近年来虽然患者生存率有所提高，但约有80-85%的卵巢癌患者会复发，并对化疗药物如顺铂产生耐受，五年生存率徘徊于30-40%。随着细胞遗传学与肿瘤病因学研究的不断深入，各种研究显示染色体不稳定性即非整倍体和结构重排(缺失、基因扩增和易位)与肿瘤的形成和发展密切相关。然而针对卵巢癌相关的多基因拷贝数变化研究尚处于起步阶段。定量多基因荧光原位杂交技术，简称QM-FISH(QuantitativeMulti-geneFluorescenceinsituHybridization)，QM-FISH技术关键在于基因组合探针设计、探针制备、标本制备和分子杂交条件的优化。相较于传

5、统的FISH技术信噪比提高了5-10倍，可以在同一时间内定量单个肿瘤细胞核的多个基因(目前可同时定量20余个基因)，且可以自由组合目的基因。该技术是寻找和确认肿瘤临床标本的特异性等位基因失衡极其有效的工具，可以用于大规模研究临床肿瘤标本基因拷贝数的变化(等位基因失衡)。此外QM-FISH对确定肿瘤细胞耐药亚群、疾病进展时的克隆演变和识别肿瘤干细胞也有显著的作用。本研究首次将QM-FISH技术应用于卵巢癌的研究，以发现进展期上皮性卵巢癌多基因拷贝数异常变化的规律。随着细胞遗传学与肿瘤病因学研究的不断深入，各种研究显示染色体不稳定性即非整倍体和结构重排(缺失、基因扩增和易位)与肿瘤的形

6、成和发展密切相关。包括比较基因组杂交等的卵巢癌基因组异常相关研究发现包括MYC、RB1、CHEK2、TP53和BRCA1等一系列重要基因在卵巢癌的发生发展中起重要作用。因此我们在研究中设计了包括该五个基因的探针组合，对合成探针所用BAC克隆进行了鉴定，并使用外周血单个核细胞对探针进行了验证。该研究将用合成的探针应用于卵巢癌标本的研究，结果发现图像清晰，能够获得满意的荧光信号强度和荧光信号强度／背景信号比值，信号分裂率低。由于临床标本种类较多，本研究进一步将QM-FISH技术应用于卵巢癌的多种标本类型包括石蜡切片、冰冻切片、组织印片和细胞甩片，对各种标本进行对比并制定出相应的标本选择

7、策略。显示出在各种标本都能获得的情况下，应该首选使用冰冻切片，其次选用石蜡切片。在给予手术治疗的患者中则应选择组织印片标本。腹水阳性的进展期卵巢癌患者无论病人手术与否都可直接使用腹水肿瘤细胞标本甩片后进行FISH检测。I天津医科大学博士学位论文研究的第二部分应用自制的荧光标记探针，分别在10名复发性进展期上皮性卵巢癌患者的腹水肿瘤细胞标本中检测了MYC、RB1、CHEK2、TP53和BRCA1共计5个基因的拷贝数异常。结果发现70%的病例中出现了MYC扩增，40%的患