口蹄疫乳酸杆菌活载体疫苗的构建及其诱导的黏膜免疫效果

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1、密级：论文编号:中囯农业科学院学位论文口蹄疫乳酸杆菌活载体疫苗的构建及其诱导的黏膜免疫效果ProtectionagainstFootandMouthDiseaseVirusinGuineaPigsviaOralAdministrationofRecombinantLactobacillusplantarumExpressingVP1硕士研究生：王淼指导教师：张永光研宄员申请学位类别：农学硕士专业：预防兽医学研宄方向：动物疫苗与分子免疫学培养单位：兰州兽医研宄所研宄生院2015年5月Secrecy:No.Chines

2、eAcademyofAgriculturalSciencesDissertationProtectionagainstFootandMouthDiseaseVirusinGuineaPigsviaOralAdministrationofRecombinantLactobacillusplantarumExpressingVP1M.S.Candidate：WangMiaoSupervisor：ProfessorZhangYongguangMajor：PreventiveVeterinaryMedicineSpecia

3、lty:AnimalVaccineandMolecularImmunologyMay2015摘要口蹄疫(Foot-and-MouthDisease，FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-MouthDiseaseVirus，FMDV)引起的一种烈性、急性家畜传染病，传播速度快，影响范围大，给畜禽养殖业造成重大的经济损失。随着规模化养殖程度的提高，FMD等传染性疫病对家畜养殖业的危害越来越严重，防治难度不断加大，传统防治措施已突显其不足，对新的防控技术、特别是安全有效的新型疫苗的需求日益迫切。VP1是编码FMDV-

4、VP1蛋白的免疫原性基因，表达的蛋白带有诱导FMD免疫反应的关键表位。本研究将FMDVVP1基因克隆并进行优化，构建重组表达质粒并检测其在大肠杆菌和乳酸杆菌中的表达，最后将重组乳酸杆菌免疫豚鼠检测其诱导的黏膜免疫保护效果。具体研究方法和结果如下：1.FMDVVP1基因的原核表达载体的构建及重组乳酸杆菌的制备从A型FMDV中克隆出VP1基因后，根据乳酸杆菌密码子偏好性对VP1进行优化，与大肠杆菌-乳酸杆菌穿梭表达载体pSIP411进行连接，并将连接产物转化到DH5α中筛选出阳性克隆菌，重组质粒酶切和PCR鉴定成功后再

5、转化到BL21中进行诱导表达，表达产物经SDS-PAGE和westernblot检测可见在24kDa处有明显的条带，证明VP1-pSIP411大肠杆菌-乳酸杆菌穿梭重组表达载体构建成功并且在BL21中得到表达的蛋白具有反应原性。然后将重组质粒pSIP411-VP1电转化到乳酸杆菌NC8和WCFS1中，通过质粒提取、双酶切鉴定和PCR鉴定等方法筛选出的阳性菌进行SppIP诱导表达，表达产物经westernblot检测可见明显的目的条带，证明VP1在NC8和WCFS1中得到表达并且具有反应原性。2.重组乳酸杆菌免疫豚鼠

6、以及免疫效果的检测动物免疫试验中将豚鼠分为5组（pSIP411-VP1-NC8，pSIP411-NC8，pSIP411-VP1-WCFS1，pSIP411-WCFS1和阴性对照组），免疫期间采集豚鼠唾液、粪便和血清样品进行ELISA检测，用流式细胞仪检测外周血中CD4+、CD8+淋巴细胞表达水平，CFSE法测定脾脏淋巴细胞增殖情况，细胞中和试验检测中和抗体含量。结果显示，两组重组乳酸杆菌免疫组抗体水平明显高于其他三组，差异显著，CD4+、CD8+淋巴细胞含量明显增多，脾淋巴细胞在抗原刺激后增殖明显，可在血清中检测到

7、中和抗体。以上结果表明，VP1在重组乳酸杆菌NC8和WCFS1中获得了表达，并且免疫动物后增强了动物的免疫功能，抵抗了FMDV的感染，为研制预防FMDV的重组乳酸杆菌疫苗奠定了实验基础。关键词：口蹄疫病毒，乳酸杆菌，VP1，黏膜免疫，豚鼠IAbstractMucosalvaccinationisaneffectivestrategyforgeneratingantigen-specificimmuneresponsesagainstmucosalinfectionsoffootandmouthdiseaseviru

8、s(FMDV).Inthisstudy,tworecombinantL.plantarumstrains—NC8andWCFS1—wereconstructedtoexpressasyntheticVP1geneofFMDVAvirus.Wesoughttoevaluatetheimmunologicalandclinicalimpactoftheplasm