受体相互作用蛋白激酶3转录调节特性研究

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1、SOOCHOWUNIVERSITY苏州大学学位论文独创性声明本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研宄工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得苏州大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的法律责任。论文作者签名:日期：苏州大学学位论文使用授权声明本人完全了解苏州大学关于收集、保存和使用学位论文的规定，艮P:学位论文著作权归属苏州大学。本学位论文电子文档的内容和纸

2、质论文的内容相一致。苏州大学有权向国家图书馆、中国社科院文献信息情报中心、中国科学技术信息研宄所（含万方数据电子出版社）、中国学术期刊（光盘版）电子杂志社送交本学位论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存和汇编学位论文，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索。涉密论文口本学位论文属在____年_月解密后适用本规定。非涉密论文口hm：^j曰期：/十-•卜1?受体相互作用蛋白激酶3转录调节特性研究中文摘要受体相互作用蛋白激酶3转录调节特性研究中文摘要目的：探讨受体相互作用蛋白激酶3

3、(receptorinteractingproteinkinase3,RIPK3)基因启动子功能序列与转录因子的相互作用及其CpG岛甲基化状态与基因表达水平的关系。方法：（1）采用生物信息学预测并分析启动子序列后，行启动子缺失突变转化分析，即PCR方法对RIPK3基因不同长度的序列片段进行扩增，以荧光素酶载体构建质粒，转染人胚肾细胞（293T细胞），采用化学发光仪检测区域启动活性，鉴定功能启动子的可能区域。利用软件预测转录因子结合位点，并通过突变转化分析鉴定RIPK3基因核心转录因子的结合位点。（2）在293T细胞中，通过检测过表达

4、转录因子刺激蛋白1(stimulatingprotein1,Sp1)/刺激蛋白3(stimulatingprotein3,Sp3)和Sp1/Sp3显性负突变体后以及基因选择性Sp1抑制剂光神霉素处理后启动子活性的检测研究转录因子刺激蛋白家族与RIPK3启动子之间的关系。（3）采用凝胶电泳迁移分析（ElectrophoreticMobilityShiftAssay,EMSA）检测转录因子Sp1/Sp3与RIPK3启动子之间的相互作用关系。（4）采用RNA干扰技术检测转录因子Sp1/Sp3在293T细胞中与RIPK3启动子的相互作用以及

5、在人大肠癌细胞（HT-29细胞）中与RIPK3表达的作用情况。（5）采用亚硫酸氢盐修饰后测序法（BisulfitesequencingPCR,BSP）研究在表达与不表达RIPK3的细胞系中以及甲基化抑制剂处理后的不表达RIPK3的细胞系中甲基化在RIPK3基因启动子区域的修饰情况。结果：（1）化学发光实验表明：RIPK3基因的5'非翻译区(5'-non-translatedregion,5'UTR)和转录起始位点(transcriptionalstartsite,TSS)上游19个碱基片段是RIPK3基因启动子的功能序列；缺失突变转

6、化分析提示该功能序列包含三个GC盒(GCbox)，其中第二个为RIPK3基因转录因子Sp1/Sp3的核心结合位点。（2）过表达研究结果表明，Sp1/Sp3对RIPK3基因启动子活性激活起主导作用。（3）凝胶电泳迁移分析的结果证实转录因子Sp1/Sp3与GC富集区特异性相互作用。（4）Sp1小干扰RNA或Sp3小干扰RNA与RIPK3启动子功能区和荧光素酶载体构建的质粒共同转染293T细胞，比较得出RIPK3启动子活性明显减低。（5）亚硫酸氢盐修饰I中文摘要受体相互作用蛋白激酶3转录调节特性研究后测序法实验结果表明，在表达RIPK3的

7、HT-29细胞系中RIPK3基因启动子功能序列低度甲基化，在不表达RIPK3的结肠癌细胞（HCT-116细胞）中RIPK3启动子功能序列呈现高度甲基化。5-氮-2'-脱氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine,5-aza-CdR)处理后，HCT-116细胞里RIPK3启动子功能序列甲基化的频率明显下降，RIPK3表达相应上调。结论：RIPK3基因的5'UTR及TSS上游19个碱基序列片段是RIPK3基因启动子的功能序列。RIPK3基因的启动活性受刺激蛋白1和刺激蛋白3剂量依赖调控。在不表达RIPK3的HCT-116里，R

8、IPK3基因的功能启动序列呈现的甲基化频率很高。该细胞系使用5-aza-CdR处理后，RIPK3基因的功能启动序列呈现的甲基化频率较前明显下降，其蛋白表达相应上调。以上结果提示，日后在治疗RIPK3相关的临床疾病过程中，我们可以尝试通