以脂肪细胞分泌因子pai-1为靶点的减肥中药复方制剂的初步筛选

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1、分类号：学校代号：10471密级：学号：2012175以脂肪细胞分泌因子PAI-1为靶点的减肥中药复方制剂的初步筛选作者姓名：朱亚楠导师姓名：宰军华学科专业：中医内科学学位类型：医学科学学位所属院部：第一临床医学院2015年4月30日河南中医学院２０１5届硕士研究生学位论文以脂肪细胞分泌因子PAI-1为靶点的减肥中药复方制剂的初步筛选研究生姓名：朱亚楠导师：宰军华教授指导组成员：冯志海教授王幼平教授崔琳主管药师学科、专业：中医内科学所属院、部：第一临床医学院中国﹒郑州２０１5年４月３０日硕±学位论文原创性声明本人所呈交的硕±学位论文，是在导师宰军华教授（或主任医师、主任药师、研究员

2、等）的指导，下，独立进行科学研巧工作所取得的成果。除文中己特别加Ｗ注明引用的内容外论文中不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的研究成果，。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体均己在文。中（＾明确方式标巧并致谢本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。特此声明。）：论文作者（签名朱私锦广年屑日令户；：硕±学位论文使用授权声明本人己完全了解河南中医学院有关保留、使用硕±学位论文的相关规定，同意学校保留或向国家有关部口，、机构送交本学位论文的复印件和电子版允许论文被查阅或借阅。本人授权河南中医学院可抖将本论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检

3、索，可采用影印、缩印或其他复制手段保存、汇编本论文：（注保密论文在解密后适巧本授权声明）。持此声明。论文作者（签名）：导师（签名）来立婦；哪寒砰年月日＾备种马目录－－摘要１－－Ａｂｓｔｒａｃｔ３ｔｔ－５－材料与方法－－７－－Ｓ果１７ｖｔ论－－２２－２６－＾－２７－Ｓ谢－２８－－－附录１图片３１－２３９－附录综述－－４４附录３科研情况摘要摘要目的：随着社会的发展，肥胖是威胁人类健康的因素，我国的肥胖问题形势十分严峻。但是目前对肥胖病因学的研究机制尚不明确，主要认为可能是饮食

4、搭配不恰当、遗传变异、缺乏活动和社会大环境等原因使人体内能量代谢的失调。大量研究显示人体内纤溶酶原激活物抑制剂-1（PAI-1）的过分表达是影响肥胖的关键因素，在人体内起重要的调节作用。本实验将前体脂肪细胞培养成为成熟的脂肪细胞，在此基础上通过PCR与质粒转染的技术，研究六种中药复方制剂对人PAI-1基因表达的影响，试图从分子生物学水平探讨中药制剂对肥胖的作用机理，为临床肥胖的治疗提供药理学基础。方法：１.中药制剂药液的制备及成熟脂肪细胞的培养：通过文献检索，将六剂中药分别以八倍水回流２次，弃药渣、过滤、离心，再将两次初步提取的药液混合后浓缩至1g/ml，灌装灭菌，分装备用，４度保存。

5、常规体外培养前体脂肪细胞3T3-L1，待细胞生长至完全融合后通过经典的鸡尾酒法将前体脂肪细胞3T3-L1诱导分化成为成熟的脂肪细胞，准备后续试验。２.用1mg/ml的中药制剂刺激成熟的脂肪细胞24h后提取RNA，采用实时荧光定量PCR技术分别检测６种中药制剂对成熟脂肪细胞分泌因子PAI-1mRNA水平的影响。３.克隆人PAI-1基因启动子片段，构建含有人PAI-1启动子片段的荧光素酶报告基因载体并进行测序鉴定。将成功构建的重组质粒瞬时转染到成熟脂肪细胞中，转染24h后加入1mg/ml的中药制剂刺激转染成功的成熟脂肪细胞并继续培养24h，收集细胞，测其荧光素酶活性，筛选出对人PAI-1启

6、动子表达有影响的制剂。结果：1.通过荧光定量PCR技术，与对照组相比，减肥胶囊药液、防风通圣散和泽泻汤对诱导成熟的脂肪细胞的PAI-1mRNA表达具有统计学意义（P＜0.05），而其余各药成熟脂肪细胞PAI-1mRNA的表达无明显统计学意义（P＞0.05），提示此三剂药物可能具有降低诱导成熟的脂肪细胞PAI-1mRNA表达的作用。２.成功构建了含有人PAI-1启动子片段的基因载体，并且所构建的重组质粒序列与基因库中人PAI-1启动子序列匹配率高达98%，虽然有碱基发生无义突变但是不影响PAI-1启动子表达，提示本实验PAI-1启动子的成功构建。３.在脂质体的介导下，将重组质粒与内参海肾

7、报告基因载体同时瞬时转染进入诱导成熟的脂肪细胞中，以pcDNA为对照载体，在转染48小时后，与pGL3-Basic相比pGL3-Basic-1.1的荧光素酶活性具有统计学意义（P＜0.05），pGL3-Basic-2.1的荧光素酶活性不具有统计学意义（P＞0.05），故将pGL3-Basic-1.1用于后续试验。1以脂肪细胞分泌因子PAI-1为靶点减肥中药复方制剂的初步筛选４.与对照组相比，减肥胶囊药液和防风通圣散对人PAI-1启动子（1.1k