vpg蛋白在兔出血症病毒翻译起始过程中的作用研究

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1、密级:论文编号:中国农业科学院学位论文VPg蛋白在兔出血症病毒翻译起始过程中的作用研究TheRoleofVPgProteininTranslationInitiationofRabbitHemorrhagicDiseaseVirus硕士研宄生：朱杰指导教师：刘光清研究员申请学位类别：兽医硕士专业领域名称：兽医培养单位：上海兽医研究所研宄生院2015年6月独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研宄工作及取得的研宄成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人己经发表或撰写过的研究成果，也不

2、包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：乂时间：■^年■^月f曰关于论文使用授权的声明本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，目卩：中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。研究生签名:时间：YiX年(月/曰中国农业科学院硕士学位论文评阅人

3、、答辩委员会签名表论文题目VPg蛋白在兔出血症病毒翻译起始过程中的作用研究论文作者朱杰专业领域兽医研究方向不区分研究方向指导教师刘光清培养单位(研究所、中心）上海_姓名职称单位专业(5签.為尸^东北农业大学刘云教授临床兽医学评动物医学学院**""*—-■丨丨中国农业大学阅封文海教授微生物学/生物学院人答n周继勇教授浙江大学微生物学主1#席秦爱建教授扬州大学预防兽医学A章光志研究员上海兽医研究所预防兽医学^答学C-马志永研究员上海兽医研究所预防兽医<辩于圣青研究员上海兽医研究所预防兽医学fii委员会议记录（秘书）顾惠明论文答辩时间

4、地点2015年5月25日，上海兽医研究所密级:论文编号:中国农业科学院学位论文VPg蛋白在兔出血症病毒翻译起始过程中的作用研究TheRoleofVPgProteininTranslationInitiationofRabbitHemorrhagicDiseaseVirus硕士研究生：朱杰指导教师：刘光清研究员申请学位类别：兽医硕士专业领域名称：兽医培养单位：上海兽医研究所研究生院2015年6月Secrecy:No.ChineseAcademyofAgriculturalSciencesDissertationTheRoleofV

5、PgProteininTranslationInitiationofRabbitHemorrhagicDiseaseVirusM.S.Candidate：JieZhuSupervisor：Prof.GuangqingLiuDegree：MasterofVeterinaryScienceSpecialty:VeterinaryMedicineJune2015摘要兔病毒性出血症（Rabbithemorrhagicdisease，RHD）是由兔出血症病毒(RHDV)引起的一种急性、致死性传染病。深入开展该病原的基础研究，可以为RHD的

6、综合防治提供理论依据和技术支持。由于兔出血症病毒缺乏在体外增殖培养的细胞系，严重阻碍了其分子生物学的基础研究。VPg蛋白为RHDV的非结构蛋白，与病毒基因组RNA5′-末端共价相连。近年来，在杯状病毒科其它成员的研究中发现，VPg蛋白在诺瓦克病毒和猫杯状病毒的翻译和复制中发挥重要作用。但VPg蛋白在RHDV生命过程中的功能还不清楚。鉴于此，本研究利用蛋白质互作、RNA干扰及反向遗传学等技术研究VPg蛋白在RHDV翻译起始过程中的功能；此外，为了克服体外增殖培养的瓶颈，我们还利用反向遗传学技术，人工构建了可在兔源细胞中稳定增殖的R

7、HDV突变体，为深入研究VPg蛋白的生物学功能及病毒的致病机制和疫苗等提供了良好的平台。本论文研究内容主要包括以下3个方面：（1）构建了pLOV-3Flag-VPg重组质粒，然后利用慢病毒包装系统，成功获得了稳定表达RHDVVPg蛋白的细胞系，并命名为RK-VPg细胞。经过PCR、RT-PCR和Westernblot实验的鉴定，结果表明RK-VPg细胞系能稳定高效的表达VPg蛋白。RK-VPg细胞系为研究VPg蛋白在RHDV生命周期中的作用提供了良好的平台。（2）通过定点突变RHDV衣壳蛋白表面高度变异区（V1）的第305位和第

8、307位氨基酸，构建了含突变位点RGD的RHDV基因组全长重组质粒pRHDVRGD。然后，将该质粒转染至RK-13细胞中，盲传三代后出现典型细胞病变。IFA、Westernblot、RT-PCR和透射电子显微镜检测结果均证明成功拯救出RHDVRGD突变株。该人工