兔出血症病毒亚基因组在昆虫细胞中的表达及其免疫原性研究

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1、分类号S855.3学校代码10129UDC614.4学号2009201074兔出血症病毒亚基因组在昆虫细胞中的表达及其免疫原性研究TheStudyofexpressionandimmunogenicityofrabbithemorrhagicdiseasevirussubgenomeintheinsectcell申请人：高景鹏学科门类：农学学科专业：预防兽医学研究方向：兽医微生物与免疫学指导教师：郝永清教授刘光清研究员论文提交日期：二〇一二年六月摘要兔病毒性出血症（Rabbithemorrhagicdisease，RHD

2、）俗称“兔瘟”，是由兔出血症病毒（Rabbithemorrhagicdiseasevirus，RHDV）引起的一种急性、烈性、致死性传染病。兔出血症病毒的主要结构蛋白是由ORF1编码的聚合多肽裂解而来，分子量约为60ku,又被称为VP60蛋白，该蛋白是兔出血症病毒最重要的免疫原蛋白。除了VP60，RHDV基因组还编码一种分子量约为10ku的次级结构蛋白，又称为VP10蛋白。研究证实，在RHDV感染细胞中除了基因组RNA外，还存在大量的亚基因组mRNA，它们的翻译产物是病毒结构蛋白的重要来源。大量研究资料表明，RHDV基因

3、组（包括亚基因组）的非编码区对病毒蛋白的翻译与表达具有重要调节作用，此外VP10的表达对于VP60的表达和组装还具有促进作用。鉴于此，本研究拟利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统表达RHDV的亚基因组mRNA,期望在非编码区和VP10的扶助下，高水平表达兔出血症病毒的VP60蛋白，解决单一表达VP60产量偏低的问题，为下一步研发抗RHDV感染的多肽疫苗奠定基础。首先，我们分别构建了pFast-sgRHDV（RHDV亚基组mRNA）和pFast-sgRHDV∆Vp10（缺失VP10编码区的RHDV亚基组mRNA）重组载体，经过蓝

4、白斑筛选获得穿梭质粒Bacmid-sgRHDV和Bacmid-sgRHDV∆Vp10，转染Sf9细胞，发现两种穿梭质粒都可以在Sf9细胞内进行增殖，并产生细胞病变。Westernblot检测结果证实，含有完整亚基组mRNA基因的表达载体转染细胞后，VP60蛋白的表达量远高于缺失VP10亚基组mRNA表达染细胞后VP60蛋白表达量，这一方面证明亚基因组在昆虫细胞中能够高水平表达病毒的结构蛋白，另一方面也证明VP10确实对VP60的表达具有调节作用。电子显微镜检测结果证实，在昆虫细胞中表达的RHDV结构蛋白VP60能够自聚形

5、成病毒样颗粒（viruslikeparticles,VLPs）。由于VLPs类似完整的RHD病毒粒子，能够模拟病毒激发宿主的免疫系统，产生特异性抗体，同时又因为不含有病毒基因组而十分安全。因此，病毒样颗粒是研发多肽疫苗的最佳候选免疫原。本文即将昆虫细胞表达的RHDVVLPs免疫试验兔，然后检测它诱导的免疫应答水平。研究结果发现，用VLPs免疫兔子后，不但可以激发高水平的体液免疫，而且可诱导机体的细胞免疫。我们使用RHDV强毒对试验兔进行攻击，发现所有免疫兔均得到良好的保护。本试验为进一步研制安全、有效的抗RHDV感染的多

6、肽疫苗奠定了基础，同时也为研究RHDV亚基因组的表达和调控机制提供了有益材料。关键词：兔病毒性出血症；亚基因组；VP60蛋白；杆状病毒；多肽疫苗TheStudyofexpressionandimmunogenicityofrabbithemorrhagicdiseasevirussubgenomeintheinsectcellAbstractRabbithemorrhagicdisease(RHD)isahighlycontagiousandlethalinfectionthataffectsbothwildanddom

7、esticrabbits.Itsetiologicalagent,therabbithemorrhagicdiseasevirus(RHDV),isconsideredtobethesinglemosteconomicallyimportantdiseaseofrabbitsworldwide.ThediseasewasfirstrecognisedinChinabutwassubsequentlyisolatedinotherareasofAsia,differentEuropeancountries,Mexico,a

8、ndelsewhere.Theetiologicalagentwasidentifiedasacalicivirus,apositive-sense,single-strandedRNAvirusthatisantigenicallyrelatedtoEuropeanbrownharesyndromevirus.Th