upa-sirna重组慢病毒载体感染兔软骨细胞对其增殖情况初步研究

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1、分类号：密级：学号：2012109085单位代码：10759石河子大学硕士学位论文uPA-siRNA重组慢病毒载体感染兔软骨细胞对其增殖情况初步研究学位申请人史东指导教师史晨辉申请学位门类级别医学硕士学科、专业名称临床医学研究方向外科学所在学院医学院中国·新疆·石河子2015年5月uPA-siRNArestructuringlentiviralvectorinfectedrabbitchondrocytespreliminarystudyonitsmultiplicationADissertationSubmittedtoShiheziUniversityInPartialFu

2、lfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMedicineByShiDong(PlantNutrition)Supervisor:ShiChenHuiMay,2015石河子大学学位论文独创性声明及使用授权声明学位论文独创性声明本人所呈交的学位论文是在我导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献妁个人和集体，均已在文中作了明确的说明并表示谢意。研究生签名:时间年6月Z曰使用授权声明本人完全了解石河子k学有关保留、使用学位论文的规定，

3、学校有权保留学位论文并向国家主管部门或指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学位论文在学校图书馆保存并允许被查阅。有权自行或许可他人将学位论文编入有关数据库提供检索服务。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。时间：j吻1年¥月Z曰时间年^I/曰摘要目的：构建靶向特异尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA）-siRNA慢病毒表达载体后并筛选出高效靶向序列，转染兔软骨细胞，观察其对软骨细胞增殖、uPA、MMP-3基因及蛋白表达水平的影响。方法：取原代生长良好的兔膝关节软骨细胞传代接种培养，根据GenBank中兔uPA基因序列，参照siRNA靶点设计原则，设

4、计、合成构建靶向兔uPA-siRNA序列，利用RT-PCR筛选高效靶向序列，按照不同的感染复数（MOI）值加入慢病毒颗粒液，共同培养后确定最佳感染复数（MOI）值，并测定分析病毒感染效率，高效靶向序列经慢病毒包装后，通过Lipofectamine2000转染兔软骨细胞，并按实验进行随机分组，分为实验组（转染uPA-siRNA慢病毒载体组）、空载体组（转染空慢病毒载体组）、空白对照组（未予任何处理组）、药物对照组（加载MMP特异性抑制剂TIMP）。细胞离体培养96h后，应用实时定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）及蛋白免疫印迹法（Westernblot）分别检测软骨细胞uPA

5、-siRNA对细胞内uPA、MMP-3mRNA和蛋白的表达水平，并通过CCK-8法检测uPA-siRNA对软骨细胞增殖的影响。结果：慢病毒载体成功转染原代软骨细胞，通过siRNA载体质粒测序与预期siRNA序列一致，DNA测序序列正确无突变，从中筛选出高效靶向序列（即沉默效果最佳）。转染后软骨细胞培养可见，早期软骨细胞呈多角形，细胞贴壁生长；传2代时，细胞呈现梭形，并聚集生长；传5代时，细胞呈现典型纤维细胞样；符合软骨细胞生长特点，可进行后续实验。随着感染复数（MOI）的增加，慢病毒的感染效率也随之增加，当感染复数(MOI)为100时感染率超过85%，符合后续实验要求。通过CC

6、K-8检测siRNA对软骨细胞增殖能力的影响发现，给予转染uPA-siRNA慢病毒载体后的软骨细胞增殖并未受到抑制。实验组uPAmRNA、MMP-3mRNA及uPA、MMP-3蛋白的表达水平显著低于空载体租、空白对照组和药物对照组（P<0.05），而空载体组、空白对照组及药物对照组uPAmRNA、MMP-3mRNA及uPA、MMP-3蛋白的表达水平差异无统计学意义（P>0.05）。结论：成功构建高效靶向uPA-siRNA慢病毒载体，其可稳定转染兔软骨细胞并能高效抑制uPA基因及蛋白表达，也可对MMP-3基因及蛋白表达呈抑制作用，对软骨细胞增殖起到促进作用。关键词：RNA干扰，慢

7、病毒载体，软骨细胞，尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA），基质金属蛋白酶3（MMP-3)论文类型：A（实验研究）IAbstractObjective：Constructionoftargetingspecificurokinase-typeplasminogenactivator(uPA)-siRNAafterlentiviralvectorandscreenedefficienttargetingsequences,transfectedrabbitchondrocyteswereobserv