tgf-β1mir-411spry4和mapk信号通路调控横纹肌肉瘤增殖与分化的机制研究

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1、$、nASOOCHOWUNIVERSITY硕士学位论文::i毛卷#‘煙二论文题目TGF-(31/miR-411/SPRY4和MAPK信号通路调控横纹肌肉瘤増殖与分化的机制研究研究生姓名黄封博指导教师姓名王守立病理学与病理生理学专业名称研究方向软组织肿瘤分子病理论文提交曰期2015年4月苏州大学学位论文独创性声明本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研宄工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得苏州大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研宂作出重要贡献的个人和集体

2、，均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的法律责任。论文作者签名:B期：>/錄苏州大学学位论文使用授权声明本人完全了解苏州大学关于收集、保存和使用学位论文的规定，即：学位论文著作权归属苏州大学。本学位论文电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。苏州大学有权向国家图书馆、中国社科院文献信息情报中心、中国科学技术信息研究所（含万方数据电子出版社)、中国学术期刊（光盘版）电子杂志社送交本学位论文的复印件和电子文档，允许论文被査阅和借阅，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存和汇编学位论文，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索。涉密论文0本学位论文属在___

3、__年_月解密后适用本规定。非涉密论文v论文作者签名：4：n4日期：2〇1^^TGF-β1/miR-411-5p/SPRY4和MAPK信号通路参与横纹肌肉瘤分化调控的分子机制研究中文摘要TGF-β1/miR-411-5p/SPRY4和MAPK信号通路参与横纹肌肉瘤分化调控的分子机制研究中文摘要目的：探讨TGF-β1抑制的microRNAs及其靶基因蛋白通过MAPK信号通路调节人类横纹肌肉瘤（RMS）肌分化及其分子机制，为RMS分化治疗提供新的治疗靶点。方法：（1）采用Real-timePCR技术检测TGF-β1抑制的microRNAs在不同RMS细胞株和组织样本中

4、的表达,筛选出差异最明显、最广泛的microRNA作为研究对象。3（2）利用MTT、H胸腺嘧啶核苷掺入法检测microRNA对RMS细胞株增殖的影响。（3）构建裸鼠成瘤性模型，观察microRNA对活体肿瘤生长的影响；采用免疫组织化学染色检测瘤体ki-67蛋白表达情况。（4）运用生物信息学技术及网络资源预测miR-411-5p的靶基因（5）运用Real-timePCR技术、双荧光素酶报告系统及蛋白印迹法验证靶基因。（6）构建Elk-1-Luc、c-Jun-Luc荧光报告质粒，SPRY4-siRNA或siRNA-ctrl转染PKC表达质粒处理的RMS细胞株，检测E

5、lk-1-Luc、c-Jun-Luc荧光信号；PKC表达质粒和SPRY4-siRNA/siRNA-ctrl共转染RMS细胞株，检测P-p38蛋白的变化。（7）MKK6EE表达质粒和/或SPRY4-siRNA共转染RMS细胞株，蛋白质印记检测P-p38蛋白、免疫荧光染色观察细胞凋亡指标（caspase-3）和肌分化指标（MHC、Myosin）的变化；MKK6EE表达和/或miR-411-5p-M、I共转染RMS细胞株，蛋白质印记法检测P-p38蛋白、免疫荧光染色观察细胞凋指标（caspase-3）和肌分化指标（MHC、Myosin）的变化；流式细胞技术细胞周期试剂

6、盒检测细胞周期的改变；miR-411-5p-M或SPRY4-siRNA3转染RMS细胞，H胸腺嘧啶核苷掺入法检测细胞增殖情况，蛋白质印记法检测I中文摘要TGF-β1/miR-411-5p/SPRY4和MAPK信号通路参与横纹肌肉瘤分化调控的分子机制研究Cleavedcaspase-3表达量。（8）Real-timePCR分析人RMS组织中TGF-β1与SPRY4mRNA的相关性。（9）采用免疫组织化学技术进行TGF-β1、SPRY4、P-p38蛋白染色，并进行临床病理相关性分析。结果：（1）在TGF-β1敲低的RMS细胞株和组织中miR-411-5p差异的最明显、

7、最广泛。（2）miR-411-5p能够抑制RMS细胞株的增殖。（3）miR-411-5p能够抑制裸鼠皮下RMS肿瘤体积增长及Ki-67蛋白表达。（4）预测miR-411-5p的候选靶基因有六个，分别为calmodulin-like4(CALML4),sprouthomolog4(SPRY4),generaltranscriptionfactor21(GTF21),transcriptionfactor(SP2),SETnuclearoncogene(SET)和glutamatereceptormetabotropic3(GRM3)。（5）SPRY4是miR-411

8、-5p的直