rgd-tat-nls介导的非病毒基因载体otmcs-pei-r18的构建

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1、学校代码：10264研究生学号：M120208450上海海洋大学硕士学位论文RGD-TAT-NLS介导的非病毒基因载题目：体OTMCS-PEI-R18的构建Constructionofnon-viralgenecarrier英文题目：OTMCS-PEI-R18modifiedbyRGD-TAT-NLS专业：食品科学与工程研究方向：生物制药姓名：朱曼曼指导教师：陈舜胜、刘克海二O一五年五月二十七日上海海洋大学学位论文原创性声明本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个

2、人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日上海海洋大学学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海水产大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年解密后适用本版权书。本学位论文属于不保密□学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月上海海洋大学硕士学位论文答辩委员会

3、成员名单姓名工作单位职称备注陈舜胜上海海洋大学教授主席陶妍上海海洋大学教授委员杨靖亚上海海洋大学副教授委员中国科学院王勇教授委员植物生理生态研究所上海沈李科工贸沈彦萍研究员委员有限公司曲映红上海海洋大学副教授秘书上海海洋大学食品答辩地点答辩日期2015.6.10学院A210上海海洋大学硕士学位论文RGD-TAT-NLS介导的非病毒基因载体OTMCS-PEI-R18的构建摘要基因治疗作为近年来兴起的新型治疗方法，针对肿瘤的发病根源，从分子水平将治疗基因导入人体靶细胞，随着基因的表达执行对肿瘤的杀伤或抑制，从而达到治疗目的。相比传统治疗，基因治疗是最有可能从根本上根除肿瘤的方法。基因治疗所面对的

4、最大瓶颈是缺乏有效的运送载体。非病毒基因载体因其化学结构可控、易于大量制备、不限制载体容量、低毒低免疫反应等优点，已成为本领域的研究热点。阳离子聚合物聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)由于具有相对较高的转染效率，成为近年来研究的热点。但大量研究表明，PEI要作为临床治疗工具，仍存在三个问题需要解决：1.毒性和转染效率之间的矛盾。高分子量的PEI(highmolecularweightpolyethyleneimine,HMWPEI)具有高的转染效率，但与此同时，存在毒性强的缺点，反之低分子量PEI(lowmolecularweightpolyethyleneimine,L

5、MWPEI)虽然毒性小，但低转染效率又成为其限制条件；2.缺乏特异的肿瘤靶向性。PEI依靠其表面携带的大量正电荷与细胞结合，缺乏对肿瘤细胞的特异选择性，限制其转染效率进一步提高；3.体内转染效率较低。期冀基因治疗最终能够应用于临床，但目前PEI或者PEI衍生物的体内转染效率远远低于体外。为了解决PEI作为基因载体存在的三个问题，本课题同时从三个点切入，设计合成了一种新型的非病毒载体。首先以低分子量PEI(2KDa)作为载体骨架，利用改性的两亲性壳聚糖OTMCS交联低分子量PEI得到高分子量PEI衍生物OTMCS-PEI。同时连接能特异结合肿瘤细胞及其新生血管高表达的整合素αvβ3的RGD肽、

6、细胞穿膜肽TAT(49-57)、核定位信号肽NLS，设计合成一种能靶向于肿瘤细胞，促进穿膜并提高核递送能力的三功能肽RGD-TAT-NLS（命名为R18）。利用交联技术将OTMCS-PEI与R18偶联，合成新型非病毒基因载体OTMCS-PEI-R18。本文评价了该载体的理化性质和体内外转染效率，并初步探究了该载体系统的入胞及胞内运转机理。为了呈现直观的评价效果，PEI25KDa、OTMCS-PEI、OTMCS-PEI-R13作为实验对照。本文第一部分，探讨了PEI作为非病毒基因载体的研究现状，在研究过程中存在的主要问题，并讨论了可能的优化策略。I上海海洋大学硕士学位论文第二部分，OTMCS-

7、PEI-R18的合成及表征。首先采用固相法制备三功能肽R18，并通过电喷雾质谱分析(MS)鉴定其序列，高效液相(HPLC)测定其相对百分含量，由MS及HPLC分析知，已按照设计序列成功合成了纯度为95.56%多肽R18。将活化的两亲性壳聚糖OTMCS与PEI2KDa连接形成OTMCS-PEI高分子聚合物，利用SMCC及半胱氨酸(Cys)的巯基将R18与OTMCS-PEI偶联得到最终产物OTMCS-PEI-R1