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1、鸦葱总黄酮纯化方法及HPLC指纹图谱的研究StudiesonPurificationandHPLCFingerprintofTotalFlavonoidsinScorzoneraaustriacaWilld.作者姓名：高敬宇专业名称：生药学指导教师：王广树教授学位类别：医学硕士答辩日期：2015年5月27日摘要鸦葱（ScorzoneraaustriacaWilld.）为菊科鸦葱属植物，为多年生草本，是一种传统中草药，在国内主要分布于东北、华北以及西北部分地区。药理实验表明，鸦葱的黄酮提取物具有保肝活性，因此对鸦葱中黄酮类化合物的研究具有很大的必要性。本论文以鸦葱为原料
2、，对鸦葱总黄酮进行提取分离，通过大孔树脂精制鸦葱总黄酮，对精制黄酮的HPLC指纹图谱进行研究，并对三种黄酮碳苷单体化合物建立HPLC-UV含量测定方法。由此为鸦葱的质量控制提供了有力保障，也为其抗肝炎病毒的药理活性研究奠定了基础。研究成果如下：1、对鸦葱中黄酮类化学成分进行提取分离。鸦葱全草10kg用70%乙醇冷浸提取3次，每次7天，提取液过滤后浓缩除醇，乙醚萃取，合并水层，经D101型大孔树脂柱吸附，收集60%乙醇洗脱组分，减压回收乙醇，干燥，得鸦葱粗黄酮提取物267g。通过硅胶柱色谱、ODS柱色谱等分离纯化手段，得到3个黄酮苷类化合物：5,7,3′,4′-四羟基-
3、6-C-β-D-吡喃葡萄糖碳苷，5,7,3′,4′-四羟基-8-C-β-D-吡喃葡萄糖碳苷和5,7,4′-三羟基-8-C-β-D-吡喃葡萄糖碳苷。2、建立鸦葱中黄酮类化合物含量测定的方法。以5,7,4′-三羟基-8-C-β-D-吡喃葡萄糖碳苷为对照品，以AlCl3-MeOH为显色剂，醋酸-醋酸钠缓冲溶液PH=5，采用紫外-可见分光光度法，检测波长390nm，测定吸光度，建立线性回归方程，用于测定鸦葱中总黄酮的含量。3、采用大孔树脂对鸦葱总黄酮纯化进行研究。通过静态吸附及动态吸附性试验发现D4020型大孔树脂对鸦葱总黄酮具有较好的吸附和解吸附性能，并且纯化物中黄酮成分含
4、量最高，故确定D4020型大孔树脂作为精制鸦葱总黄酮的最佳树脂。将鸦葱粗黄酮提取物用水溶解过滤后上样于D4020型大孔树脂柱，先以5%乙醇溶液洗脱，除去糖、蛋白质和萜类等杂质，再收集10%-30%乙醇溶液洗脱部分，得到纯化后的鸦葱黄酮类化合物，黄酮含量提高至90%以上。4、鸦葱精制黄酮HPLC指纹图谱的建立。依照上述方法对12批鸦葱药材的粗黄酮提取物进行纯化，以已经分离得到的5,7,3′,4′-四羟基-6-C-β-D-吡喃葡萄糖碳苷色谱峰为参照，通过对色谱条件进行单因素考察建立精制后鸦葱总黄酮的HPLC特征指纹图谱。确定色谱条件为PhenomenexGemini5μm
5、C18110A（250mm×4.6mm，5μm）-1色谱柱，流动相A为色谱乙腈、B为0.1%甲酸-超纯水，流速0.8ml·min，柱温25℃，检测波长337nm，进样量10μL。梯度洗脱程序是0.01~7.00min，97~86%B；7.01~30.00min，86~83%B；30.01~60.00min，83~65%B；60.01~65.00min，65~0%B。标定14个共有峰构成鸦葱精制黄酮的特征指纹图谱，峰面积占总峰面积90%以上，其中3个共有峰与对照品相对应。12批鸦葱精制黄酮的HPLC指纹图谱相似度均在0.9以上，一致性良好，由此建立了共有模式图。5、采用
6、HPLC-UV法建立鸦葱中三种黄酮苷类成分5,7,3′,4′-四羟基-6-C-β-D-吡喃葡萄糖碳苷，5,7,3′,4′-四羟基-8-C-β-D-吡喃葡萄糖碳苷和5,7,4′-三羟基-8-C-β-D-吡喃葡萄糖碳苷的含量测定方法。经方法学验证线性关系良好，具有良好的精密度和稳定性，加样回收率在98%~99%之间。应用此法对12批次鸦葱精制黄酮样品进行成分的含量测定，在不同批次中含量的差异，体现了鸦葱中黄酮成分的个体特征。关键词：鸦葱，黄酮，大孔树脂，纯化，指纹图谱，高效液相色谱，含量测定ABSTRACTTheScorzoneraaustriacaWilld.isper
7、ennialherbofCompositae.Asatradionalmedicineherb,ScorzoneraaustriacaWilld.isdistributedinthenorthandpartofnorthwestofChina.PharmacologicalexperimentsprovedhepatoprotectiveeffectofflavonoidsextractfromScorzoneraaustriacaWilld.ThereforeitisnecessarytostudyonflavonoidsinScorzoneraa
