鸡三种免疫抑制病基因芯片检测方法的建立

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1、TheDistributionofGeneChipforThreeKindsofAvianImmunosuppressiveDiseasesADissertationSubmittedinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofAgronomyCandidate：ZhuRuihaoSupervisor:Prof.ZhaoKun;YangBingHenanInstituteofScienceandTechnologyJune,

2、2015摘要近年来，禽类免疫抑制病在我国养禽业中迅速蔓延，严重地威胁着养禽业的健康发展，禽类免疫抑制病在临床上主要依靠疫苗和药物来防控和治疗；但其中一些疫病迄今为止仍无有效的疫苗和药物，此类疫病在临床上主要通过对病原进行检测，从而达到净化和防控的目的。本研究基于多重PCR技术，建立了鸡传染性贫血病、禽网状内皮组织增殖病和区分禽白血病A、C、D亚群的基因芯片检测方法。根据NCBI收录的鸡传染性贫血病毒、禽网状内皮增生症病毒与禽白血病病毒A、C、D亚群参考毒株的序列，设计合成3对特异性扩增引物，将下游

3、引物进行Cy3荧光标记，建立多重PCR体系；并参考目的序列内保守区域，设计合成10条寡核苷酸探针，按照矩阵设计，点制在醛基化玻璃基片上，制作寡核苷酸探针基因检测芯片；提取病毒核酸，进行多重PCR扩增后与探针进行杂交，然后用荧光检测仪扫描并分析结果。经杂交反应后，芯片能够同时检测鸡传染性贫血病病毒和禽网状内皮增殖病病毒，7并能区分禽白血病病毒A、C、D亚群，其灵敏度能够到达10copies/mL，并且具有较高的特异性。基因芯片对450份临床样品检测的结果与ELISA抗体检测结果相比符合率高。本研究结

4、果证明，基因芯片技术是一种有效地检测鸡传染性贫血病毒和禽网状内皮增殖病病毒，并能区分禽白血病病毒A、C、D亚群的方法，为今后在临床应用中快速鉴别诊断鸡传染性贫血病病毒、禽网状内皮增生症病病毒与禽白血病病毒A、C、D亚群提供可行性。通过本研究方法建立了禽白血病基因芯片，对同一只鸡的全血、血清、蛋清和泄殖腔棉拭子等进行跟踪检测。检测结果显示，基因芯片方法检测全血的阳性率为69.23%；ELISA试剂盒检测蛋清样品中p27抗原的阳性率为23.08%。芯片检测率显著高于ELISA试剂盒检测率，且全血是用于

5、禽白血病基因芯片检测的最优材料。关键词：鸡传染性贫血病病毒；禽白血病病毒；禽网状内皮组织增殖病病毒；多重PCR；基因芯片IABSTRACTInrecentyears,AvianimmunosuppressivediseaseshavespreadrapidlyinChinesepoultryandseriouslyharmedpoultryhusbandry.avianimmunosuppressivediseaseshavenoeffectivecommercialvaccineordrugst

6、opreventionandtreatment.Pathogendetectionisimportanttopurificationofflocks.Inthisstudy,agenechipassaywasdevelopedtodetectchickeninfectiousanemiavirus,reticuloendotheliosisvirusandavianleukosisvirussubgroupsA,CandDbasedonthemultiplexPCR.Thereferenceseq

7、uencesofCAV,REV,ALVsubgroupsA,CandDwereobtainedfromGenBank,Threepairsofprimersofthosegenesweredesignedandsynthesized,thedownstreamprimerswerelabeledbyCy3.Then,multiplexpolymerasechainreactionsystemwasbuilt.Inaddition,Tenprobesofthosegenesweredesigneda

8、ndsynthesizedbasedontheconservativeregionofsequences.Accordingtothedesigningmatrix,theprobeswerespottedtotheglasssubstrateusingthechipmicroarrayer.ThetotalDNAwasextractedfromseveralviruses.TheproductswhichamplifiedbymultiplexPCRusingthelabeled