马传染性贫血病毒p26蛋白抗原表位鉴定与ac-elisa方法的建立

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1、密级:论文编号:中国农业科学院学位论文马传染性贫血病毒p26蛋白抗原表位鉴定与AC-EL1SA方法的建立EpitopemappingandAC-ELISADevelopmentofEquineInfectiousAnemiaVirusp26硕士研宄生：常浩指导教师：王晓钧申请学位类别：农学硕士专业：预防兽医学研究方向

2、培养单位：哈尔滨兽医研究所研宄生院2015年6月密级:论文编号:中国农业科学院学位论文马传染性贫血病毒p26蛋白抗原表位鉴定与AC-ELISA方法的建立EpitopemappingandAC-ELISADevelo

3、pmentofEquineInfectiousAnemiaVirusp26硕士研究生：常浩指导教师：王晓钧申请学位类别：农学硕士专业：预防兽医学研究方向：动物传染病及其病原分子流行病学培养单位：哈尔滨兽医研究所研究生院2015年6月Secrecy:No.ChineseAcademyofAgriculturalSciencesDissertationEpitopeMappingandAC-ELISADevelopmentofEquineInfectiousAnemiaVirusp26M.S.Candidate：HaoChangSu

4、pervisor:XiaojunWangMajor：MasterofVeterinarianSpecialty:AnimalInfectiousDiseasesAndMolecularEpidemiologyJune2015III摘要马传染性贫血（Equineinfectiousanemia,EIA）是一种能够感染马、驴和斑马等马属动物的动物性传染病。它能够引起马属动物贫血、血小板减少、发热、消瘦和多器官衰竭等症状。EIA由Ligné于1843年在法国首次发现，现已在美洲、欧洲、中东和南非等世界范围都有流行，使当地畜牧业，赛马业

5、和相关产业遭受巨大经济损失。解放前期，我国也曾出现EIA流行，但在20世纪70-80年代由于沈荣显等人研制出EIAV弱毒疫苗，从而使疫病得到有效控制。马传染性贫血病毒（Equineinfectiousanemiavirus,EIAV）是引起EIA的病原体。EIAV属于反转录病毒科慢病毒，同其他慢病毒如人类免疫缺陷病毒（Humanimmunodeficiencyvirus,HIV）、猴免疫缺陷病毒（Simianimmunodeficiencyvirus,SIV）和猫免疫缺陷病毒（Felineimmunodeficiencyviru

6、s）类似，EIAV包含有Gag、Pol和Env3个主要的结构蛋白和Tat、Rev和S23个非结构蛋白。Gag蛋白作为多聚蛋白，最终可以剪切为基质蛋白（MA）、衣壳蛋白（CA）、核衣壳蛋白（NC）和p9蛋白，这些蛋白都作为病毒粒子结构的一部分而存在。EIAV衣壳蛋白又称为p26蛋白，它的主要功能是自我组装形成病毒的衣壳结构，其构成的拓扑学结构包裹EIAV的基因组以确保病毒的有效复制。同时作为病毒感染过程中的主要免疫原性蛋白，p26在不同EIAV株的结构与功能高度保守。并且p26蛋白也是病毒粒子中丰度最高的蛋白之一。本研究通过实验室

7、制备的2株EIAVp26单克隆抗体:MAb1G11和MAb9H8，利用肽扫描技术，最终通过免疫印迹试验（westernblot）鉴定出MAb1G11和MAb9H8所针对p26蛋白的线性表199218位。MAb1G11针对p26蛋白C端的20个氨基酸：KNAMRHLRPEDTLEEKMYAC；MAb9H8则针对N7380端的8个氨基酸：NLDKIAEE。这对于分析p26蛋白结构与功能以及以表位为基础建立诊断方法提供了依据，也对基于表位的疫苗设计具有指导意义。在国务院颁布的《国家中长期动物疫病防治规划（2012—2020年）》中，明

8、确指出要对EIA开展持续监测，对经济娱乐用马以及高风险区域的马属动物进行重点监测，从而加快推进马传染性贫血消灭行动。根据生产实际和国家发展纲要，建立快速有效的诊断EIA的方法显得尤为迫切与重要。传统检测EIAV的方法是利用p26蛋白检测EIAV抗体的琼脂扩散试验（Agargelimmunodiffusion,AGID），又称为Coggins试验。尽管AGID在检测EIAV高度特异，但是缺乏敏感性。这对于检测处于慢性期和非明显期的临床症状的EIA感染尤为不利。同时只能通过肉眼观察抗原抗体结合的沉淀线粗细来对EIAV含量进行粗略判断

9、，并无法对病毒进行定量分析。再次，由于试验周期较长，无法对疾病进行快速诊断，使得在生产实践无法对疫情做到及时有效防控。本研究所鉴定的线性表位分别针对p26蛋白的N端与C端。其所针对的差异表位特性，为本实验建立抗原捕获ELISA（AntigenCapture-EL