额尔齐斯河鱼类三代虫分类、流行情况及系统发育研究

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分类号：Ｓ９４１．５２＋１学校代码：１０７５８１２３６０２０３１７：密级：公开学号资ｉ寺丈拳硕±学位论文额尔齐斯河鱼类Ｈ代虫分类、流行情况及系统发育研究ＳｔｕｄｉｅｓｏｎＣｌａｓｓｉ打ｃａｔｉｏｎＥｉｄｅｍｉｏｌｏａｎｄＰｈｌｏｅｎｅｔｉｃ，ｐｇｙｙｇ巧加ｃ皆／ｗｓｏｆＦｉｓｈｉ打ＥｒｇｉｓＲｉｖｅｒ■ｆ■＂－了＇张薇．研究生姓華导师姓省及职称岳城教授学位口类级别农学硕壬专业毒称预防兽医学＊研究方向鱼类寄生虫学研究？所在学院动物医学学院新疆？乌鲁木齐二〇—五年六月 独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得。尽我所知，论文中的研究成果，除了文中特别加示注和致谢的地方外不包含其他人己经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得新疆农业大一学或其他教育单位的学位或证书而使用过的材料。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。！研究生签名：誘＾时间；如／Ｘ年／月＾日关于学位论文使用授权的说明文的规定，即：新本人完全了解新疆农业大学有关保留、使用学位论疆农业大学有权保留并向国家有关部口或机构送交论文的复印件和电子文挡，可采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，允许论文入有被关查阅和借阅。本人授权新疆农业大学将学位论文的全部或部分内容编数据库进行检索，可公布（包括刊登）论文的全部或部分内容。研（保密的学位论文在解密后应谱守此协议）究生签名；拂粗时间；矿年月／＾导师签名：时间：年＾月 本文是“国家自然科学基金项目”《额尔齐斯河鱼类单殖吸虫种群生物学及系统发育研究》（NO:31160535）、科技支疆项目《新疆主要土著经济鱼类病害防治关键技术开发》（NO:201191136）和“淡水生态与生物技术国家重点实验室开放性课题”《额尔齐斯河鱼类单殖吸虫种群生物学》（NO:2011FB06）的部分研究成果项目主持人：岳城教授（新疆农业大学动物医学学院） 额尔齐斯河鱼类三代虫分类、流行情况及系统发育研究摘要三代虫隶属于单殖吸虫纲（Monogenoidea）、三代虫目（Gyrodactylidea）、三代虫科（Gyrodactylidae）、三代虫属（Gyrodactylus），是一种鱼类体表寄生虫，对宿主可造成较大的危害。本文采取常规的鱼类调查、统计学方法及分子生物学方法，对额尔齐斯河水域中鱼类三代虫进行调查研究，阐明了该流域中三代虫的种类以及感染情况，同时结合形态学和分子生物学方法对其种类进行鉴定，并进行了系统发育研究。结果如下：（1）通过光镜和扫描电镜观察三代虫的形态特征，对其几丁质结构进行测量及比较，共鉴定三代虫14种，其中白斑狗鱼三代虫（G.lucii）、丁鱥三代虫（G.tinca）、马氏三代虫（G.markakulensis）、梭鲈三代虫（G.luciopercae）为中国新纪录种，本文对新纪录与相似种进行比较，并进行了绘图和描述。（2）通过对三代虫感染率、感染强度、感染丰度等进行分析，结果表明三代虫感染率最高的为鲤23.94%，最低的为河鲈0.74%，除东方欧鳊、散鳞镜鲤和鲤外，其余的2感染率均不超过10%；银鲫、散鳞镜鲤和鲤为易感宿主，方均比（S/X）都大于1，呈聚集分布；其余的小于1，呈均匀分布。（3）通过对三代虫寄生宿主种类统计，分析结果表明大多数三代虫感染一种宿主，少数种类三代虫感染可2～4种宿主情况，也有同一宿主感染2～3种三代虫的现象。（4）结合形态学方法和分子生物学方法（ITS1-5.8S-ITS2rDNA标记），对银鲫、东方欧鳊、粘鲈、金鳟体表感染的三代虫进行鉴定，结果显示三代虫种类分别为：细锚三代虫（G.Sprostonae）、秀丽三代虫（G.elegans）、细鳞鲑三代虫（G.brachymystacis）、普氏三代虫（G.prostate）。将所得ITS序列与GenBank比对相似率在99%以上，上传获得基因登录号分别为：KP295469、KP325623、KP295468、KP325622；对这四种三代虫的系统发育进行研究，细鳞鲑三代虫和细锚三代虫位于Limnonephrotus亚属的一枝，秀丽三代虫和普氏三代虫位于Gyrodactylus亚属的一枝，两亚属亲缘关系较远。该研究结果为新疆的水产业发展和我国三代虫的研究提供了基础的资料。关键词：三代虫；种类鉴定；感染率；ITS；额尔齐斯河I StudiesonClassification,EpidemiologyandPhylogeneticGyrodactylusofFishinErgisRiverAbstractGyrodactylusbelongstoMonogenoidea,Gyrodactylidea,Gyrodactylidae,Gyrodactylus,isakindoffishparasites,itisharmtohost.Thispaperadoptstheconventionalfishsurvey,statisticalmethodsandmolecularbiologicalmethods,dotheresearchofGyrodactylusinErgisRiver.ThisstudywestudiedthespeciescompositionandpopulationdynamicsofGyrodactylus,andidentifiedwithmorphologicalmethodsandmolecularmethods,andtostudythephylogeny.Theresultsshowthat:(1)ThroughLightmicroscopyandScanningelectronmicroscope,weobservedthemorphologicalcharacteristicsofGyrodactyluswithastainingmethodandplotted,measuredandcomparedthestructuresofchitin.Totally14kindofGyrodactyluswereidentified.Ofthem,fournewrecordsincludingG.lucii,G.tinca,G.markakulensisand,G.luciopercae,werefoundforthefirsttimeinChina.Inthispaper,anewrecordwithsimilarspecieswerecompared,andthedrawinganddescription.(2)Wealsoanalyzedanddiscussedtheinfectionrates,infectionintensity,infectionabundance.Theresultsshowthatthemost-infectedhostwasCyprinuscarpio(23.94%),andtheleast-infectedhostwasPercafluviatilis(0.74%).ExceptAbramisbramaandCyprinuscarpiohaematopterrusandCyprinuscarpio,theinfectionratesinotherfishspecieswerelessthan10%.ThemostsusceptiblehostswereCarassiusauratusgibelio,Cyprinuscarpio2haematopterrusandCyprinuscarpio,withmeanssquaredvalues(S/X)alllargerthan1andinaggregatedistributions.Themeanssquaredvaluesofinfectionratesinotherfishspecieswereallsmallerthan1andinuniformdistributions.(3)ThroughstatisticsofGyrodactylushostspecies,theresultsshowthatthehostspecificityofGyrodactylusisverylarge,butafewGyrodactylusspeciescaninfect2to4hosts,andseveralGyrodactylusspeciesmayinfectthesamehost.(4)Combinedstainingelectronmicroscopymorphologyandmolecularbiologymethods(ITS1-5.8S-ITS2rDNAmarkers).IdentificationthesurfaceinfectionofGyrodactylusforCarassiusauratusgibelio,Abramisbramaorientalis,Acerinacernua,Oncorhynchusmykiss.TheresultsshowGyrodactylusspecieswere:G.Sprostonae,G.elegans,G.brachymystacis,G.prostate.ITSsequencesinGenBanksimilarrateofmorethan99%;anduploadobtaingeneaccessionnumbersare:KP295469,KP325623,KP295468,KP325622;andstudyoffourGyrodactylusphylogenetic.PhylogeneticStudiesshowsthatG.brachymystacisG.SprostonaelocatedLimnonephrotusasubgenus,G.elegansandG.prostatelocatedGyrodactylusasubgenus,thephylogeneticrelationshipbetweentwosubgenusarerelativelyfaraway.ItistoprovidessomebasicdataforthefisherydevelopmentinXinjiangandtheresearchonGyrodactylusinChina.Keywords:Gyrodactylus;speciesidentification;infection;ITS;ErgisRiverII 目录第1章绪论.......................................................................................................11.1三代虫概况...............................................................................................................11.2国内外研究进展.......................................................................................................11.3形态学与分类学.......................................................................................................31.3.1形态学................................................................................................................31.3.2分类历史............................................................................................................41.4生活史与繁殖特性...................................................................................................51.5流行病学及宿主特异性...........................................................................................51.5.1分布....................................................................................................................51.5.2寄主范围............................................................................................................61.5.3寄生特点............................................................................................................61.6生态因素对三代虫的影响.......................................................................................71.6.1环境因素影响....................................................................................................71.6.2宿主免疫学........................................................................................................81.6.3宿主的因素........................................................................................................91.6.4种群分布与竞争..............................................................................................101.7危害及防治.............................................................................................................101.7.1危害..................................................................................................................101.7.2防治..................................................................................................................111.8系统发育学研究.....................................................................................................121.8.1分子系统发育概况..........................................................................................121.8.2三代虫系统发育概况......................................................................................131.9研究目的及意义.....................................................................................................15第2章额尔齐斯河鱼类三代虫分类及流行特点........................................162.1材料方法.................................................................................................................162.1.1样品来源..........................................................................................................162.1.2仪器、用具......................................................................................................172.1.3试剂..................................................................................................................172.1.4采集保存..........................................................................................................172.1.5染色制片镜检..................................................................................................172.1.6虫体鉴定..........................................................................................................182.1.7统计方法..........................................................................................................182.2结果.........................................................................................................................182.2.1额尔齐斯河三代虫名录..................................................................................18III 2.2.2鱼类三代虫感染情况......................................................................................252.3讨论.........................................................................................................................27第3章中国三代虫属4新纪录种的记述....................................................293.1材料方法.................................................................................................................293.2结果.........................................................................................................................303.2.1白斑狗鱼三代虫GyrodoctylusluciiKulakowskaja，1951...........................303.2.2丁鱥三代虫GyrodactylustincaMalmberg，1957.........................................303.2.3马氏三代虫GyrodactylusmarkakulensisGvosdev，1950............................303.2.4梭鲈三代虫GyrodoctyluluciopercaeGusev，1962......................................313.3讨论.........................................................................................................................33第4章额尔齐斯河部分鱼类三代虫种类鉴定及系统发育研究................344.1材料和方法.............................................................................................................344.1.1材料来源..........................................................................................................354.1.2目的基因的提取及PCR扩增........................................................................354.1.3目的基因的测定..............................................................................................354.2结果.........................................................................................................................364.2.1四种三代虫ITS1-5.8S-ITS2序列分析..........................................................364.2.2四种三代虫ITS1-5.8S-ITS2遗传距离分析..................................................374.2.3三代虫系统进化树..........................................................................................374.3讨论.........................................................................................................................40第5章结论.....................................................................................................43参考文献.............................................................................................................44附录Ⅰ常用试剂的配制.................................................................................50附录Ⅱ部分实验鱼和寄生虫标本.................................................................53致谢.................................................................................................................57作者简介.............................................................................................................58IV 插图和附表清单图1-1三代虫模式图………………………………………………………………………3图1-2三代虫几丁质结构鉴别要点及测量方法…………………………………………5表1-1温度对三代虫种群动态的影响…………………………………………………8图2-1额尔齐斯河水系分布及采样点分布图…………………………………………17图2-2细鳞鲑三代虫GyrodoctylubrachymystacisErgens，1978………………………19图2-3白斑狗鱼三代虫GyrodoctylusluciiKulakowskaja，1951………………………20图2-4丁鱥三代虫GyrodactylustincaMalmberg，1957………………………………20图2-5秀丽三代虫GyrodoctyluselegansNordman，1832……………………………21图2-6普氏三代虫GyrodactylusprostateErergns，1963………………………………21图2-7马氏三代虫GyrodactylusmarkakulensisGvosdev，1950………………………22图2-8鮈三代虫GyrodoctylusgobionumGussev，1955………………………………22图2-9中型三代虫GyrodoctylusmediumKathariner，1893……………………………23图2-10鲤三代虫GyrodoctyluscypriniDiarova，1964…………………………………23图2-11细锚三代虫GyrodoctylussprostonaeLing，1962………………………………24图2-12江鳕三代虫GyrodoctyluslotaeGussev，1953…………………………………24图2-13梭鲈三代虫GyrodoctylusluciopercaeGusev，1962…………………………25表2-1额尔齐斯河三代虫种类及感染情况……………………………………………26表3-14种三代虫新纪录种的形态结构数据与其相似种的比较………………………32V 表4-1PCR反应体系……………………………………………………………………35表4-2实验所用和参考的单殖吸虫的种类及序列信息………………………………36图4-3四种三代虫的ITS1-5.8S-28SrDNA序列………………………………………38图4-4秀丽三代虫与普氏三代虫ITS1-5.8S-ITS2rDNA序列同源性比较结果………39图4-5ITS1-5.8S-ITS2rDNA区域的遗传距离…………………………………………39图4-6运用NJ法构建的ITS1-5.8S-ITS2rDNA序列进化树…………………………40VI 英文缩略词表英文缩写英文全称中文全称MinMinute分钟sSecond秒hHour小时℃Centidegree摄氏度bpBasepair碱基对pHPowerofhydrogen酸碱度AmpAmpicillin氨苄青霉素LBLuria-BertanimediumLB培养基ITSIntertranscriptionspacer内转录间隔区COIcytochromeoxidaseI线粒体细胞色素氧化酶IGSRibosomalintergenicspacer核糖体基因间隔区PCRPolymeraseChainReaction聚合酶链式反应NJNeighborjointing邻接法rDNARibosomalDeoxyribonucleicAcid核糖体DNA基因EDTAEthylenediaminetetraacetaticacid乙二胺四乙酸VII 新疆农业大学硕士学位论文第1章绪论1.1三代虫概况三代虫隶属于单殖吸虫纲（Monogenoidea）、三代虫目（Gyrodactylidea）、三代虫科（Gyrodactylidae）、三代虫属（Gyrodactylus），因其母代体内孕育着子代，在子代体内[1-2]有孕育着下一代，所以称为三代虫。该寄生虫是单殖吸虫中少有的以胎生为繁殖方式的体外寄生虫，多寄生于淡水鱼类的腮部和鳍部，主要以锚钩和小钩固着于鱼类体表，靠吸取粘液和分泌物为食，这给鱼类体表带来机械损伤，易引起继发感染，导致烂鳃病[2]和其它继发性疾病等。由于三代虫对水产养殖影响较大，尤其是育苗阶段易造成鱼苗大面积死亡，因此被称为寄生虫界的“果蝇”，一直以来备受水产病害研究和寄生虫学[1-3]者的关注。1.2国内外研究进展[4]三代虫在全世界分布广泛，现已报道400余种。最早是1832年Nordomann在鲤[5]科鱼上发现的Gyrodactyluswagneri，至今已180余年。当时在显微镜使用的初期，尽管意识到腹中的胚胎和锚钩但很难区分，所以认为三代虫的繁殖方式为卵生，腹中的几丁质结构为胃钩。随后到1849年，VonSieboldt质疑了该观点，提出三代虫是一种雌雄[6]同体的扁形虫体，为胎生繁殖，并表明了该繁殖方式具有很高的研究价值。虽然当时单殖吸虫的分类还不是很明确，但已经明确发现该虫体可在子宫内孕育成熟的下一代，当子代虫体从母代子宫脱离时也同时孕育着下一代，虽然随后母体会死亡，但母代与子代的之间这种孕育方式及“再生”能力，使得人们对它产生浓厚研究兴趣。1893年，Kathariner等尝试通过组织化学和X射线元素方法分析三代虫的骨片来研究三代虫的生[8]物学特性，后来随着科学技术的发展，三代虫在遗传染色体对的选择、胚胎早期研究、[9-10]细胞等领域都有一定研究，这足以证明对三代虫的研究价值及意义。伴随着水产养殖业和海洋捕捞规模不断壮大，鱼类养殖密度和水体环境的改变，三代虫疾病逐渐在人工养殖和天然水体流域爆发。1901年Atkins在鱼类疾病研究中提到1 额尔齐斯河鱼类三代虫分类、流行情况及系统发育研究[11][12]了三代虫的防治，1924年Embody发表了一篇关于如何防控虹鳟鱼三代虫的文章，从此三代虫疾病开始进入人们视野，但其作为一种鱼类体表寄生虫病并没有引起普遍重视。直到上世纪70年代中期，大西洋鲑三代虫（G.salaris）导致挪威的大西洋鲑（Salmo[13]salar）养殖业造成重创，两年之内幼鱼数量下降50%，这使得三代虫病第一次在国际上公开报道。后来MoTA等表明，到1994年，挪威有37条河流中的大西洋鲑都被该病[14]原感染。随后大西洋鲑三代虫很快在俄罗斯河和瑞典南部西海岸的河流爆发流行，当时考虑到周边诸多国家及河流有大西洋鲑，为防止苏格兰、爱尔兰等感染，已将大西洋鲑三代虫列为大西洋口岸水产品的检验项目之一，从此三代虫在经济上的重要逐渐得到普遍重视。虽然其它种类的三代虫虽未被列为口岸检疫对象，但也应引起高度重视，这[7]种潜在的威胁不断驱使生物学家以及地理学家们对其研究，自1980～1985年有30多篇有关三代虫致病性及分类的研究三代虫的论文发表，1999～2003年有约100多篇已发[15]表的论文研究内容同时涉及了三代虫的进化、分类学、生态和动物地理等诸多方面。[4]直到2004年，Harris整理了诸多资料，统计出现已报道的三代虫共计402种。[1]1948年，我国开始了三代虫的研究，当时首次发现的是鲫鱼的秀丽三代虫，研究[16]进展相对国外较慢。1990年，Л·米尔祖耶娃和刘澧津在虹鳟鱼病中提到了三代虫防治，[17]1998年夏晓勤报道了黄颡鱼体表寄生三代虫的病例，自1990～2000年，有10余篇[16-25]已发表的文章中涉及三代虫。后来张其中、王昭明、刘澧津等对鲑科鱼类、南方鲶[21-24]等鱼类体表寄生的三代虫疾病防治和药用实验开展研究。姚卫建等人对三代虫种类[26]鉴定进行进一步区分，建立检索表。2000～2002年研究逐渐深入，疾病诊断更系统化，王青辑、邬国民、白桂芝、朱桂生等对三代虫疾病诊断进一步描述，对三代虫的发[27-30]病季节、感染特点有了进一步掌控；夏小勤、刘汉生、刘继芳等在鱼类寄生虫宿主特异性和协同进化及生态问题的研究中，表明了三代虫对于单殖吸虫的研究具有一定价[31-33][34]值和意义；2008年王艺秀等对鱼类寄生三代虫宿主特异性做了进一步分析研究。伴随着国内水产行业进一步发展及生物技术的不断提高，新的三代虫种类不断被发现[35][36]，三代虫的生活史等问题逐渐被学者探究。由于三代虫比较相似，单一的形态鉴定已经不能定种，电镜技术和分子生物学技术逐渐被应用到三代虫的疾病诊断和种类鉴定[37-38][39]中。截止到2012年，贺怀亚等整理了三代虫的物种名录，共计52种。其中最常2 新疆农业大学硕士学位论文见的主要是秀丽三代虫（G.elegans）、中型三代虫（G.medium）、细锚三代虫（又名史若兰三代虫）（G.sprostonae）、鲤三代虫（G.cyprini）、细鳞鲑三代虫（G.brachymystacis）、[15-26]细鳞鱼三代虫（G.lenoki）等。1.3形态学与分类学1.3.1形态学三代虫虫体较小，和指环虫形态相比无眼点（详情见图1-1）。虫体全长约为0.2～0.9cm，透明，背腹扁平，形状呈柳叶形。在虫体外部有类似纤毛运动的细胞，当母体[7]将幼体排除体外时，可通过此方式及身体的蜷缩运动到新的宿主体表。1.头叶（Ceplicglands）；2.头腺（Ceplicglands）；3.咽（Pharynx）；4.食道（Esophagus）；5.交配囊（Cirruspouchs）；6.第二代胚胎（Thesecondgenerationofembryonic）；7.第一代胚胎（Thefirstgenerationembryo）；8.肠支（Intestinalbranch）；9.卵模（Eggmold）；10.卵巢（Ovary）；11.睾丸（Testis）；12.卵黄囊（Yolk）；13.中央大钩（Anchor）；14.背联结片（Endconnector）；15.腹联结片（Ventralbars）；16.后吸器（Opisthohapterelements）；17.边缘小钩（Marginalhooks）图1-1三代虫模式图Fig.1-1ThemodepatternofGyrodactylus3 额尔齐斯河鱼类三代虫分类、流行情况及系统发育研究在虫体前端腹面有一口器；前方有一对头器，由2组单细胞组成的腺体组成，是三代虫重要的生物学感觉器官；咽部肌肉发达，由八个肌肉和两个单细胞头腺组成；咽部后方为食道、交配囊（又叫交接器），交配囊因种类不同有数量形状不同的大、小刺。虫体中部两侧为肠分枝，有末端无侧分枝；通常有一代胚胎和二代胚胎，偶尔可见第三代，胚胎呈椭圆状；中后部为生殖系统和排泄系统。生殖系统可见卵膜、卵巢、睾丸、卵黄腺依次排开，睾丸在中间，形状多为V形；排泄系统主要是焰细胞组成，后和[1]排泄管相连形成排泄囊，并在排泄孔处开口。虫体后部为后吸器。有一个中央大钩和16个边缘小钩围绕而成，呈伞状；中央大钩上横着一个背联结片、一个腹联结片；大钩、小钩将虫体固定在宿主体表。1.3.2分类历史1957年Malmberg对宏三代虫（Gyrodactyluspolypteri）的形态进行简要描述，但分[8]类系统还未清楚，没有提出统一的分类标准。Wagener也表明秀丽三代（G.elegans）[9][7]和中型三代虫（G.medium）形态不易区分，这阻碍了三代虫在一些生态领域的研究。直到1970年，Malmberg结合自己多年来的研究（1957，1969，1970）首次提出以焰细[40-42]胞排泄系统和边缘小钩为依据的鉴别方法，将三代虫分为六个亚属，分别是：Gyrodactylus，Mesonephrotus，Paranephrotus，Metanephrotus，Neonephrotus和Limnonephrotus，该方法对今后的三代虫分类学研究奠定了基础。资料显示《中国动物[1,42]志》中三代虫的测量方法与Malmberg大多相同（详情见图1-2），但由于焰细胞鉴别很容易受仪器及实验者的自身知识水平限制，同时背联结棒容易受生物影响，未被沿[3,7]用。目前人们在贝霍夫斯基（Bychowsky）的单殖吸虫分类学基础上，结合Mamaev、[1]Lebedev、Gussev及《中国动物志》中有关三代虫的分类资料，将三代虫归属为：单殖吸虫纲，多钩亚纲（PolyonchoineaBychowsky，1937），三代虫目，三代虫科，三代虫属。4 新疆农业大学硕士学位论文A中央大钩：a.中央大钩全长；b.钩基部长；c.钩尖长；d.钩拐角；e.内突长。B背联结片：a.长；b.宽。C腹联结片：a.长；b.宽；c.裙片长；d.耳状突长。D边缘小钩：a.全长；b.钩柄长；c.钩体长；d.扣环。E交配囊：a.长；b.宽。图1-2三代虫几丁质结构鉴别要点及测量方法Fig.1-2MethodofmeasuringopisthaptorhardpartsofGyrodactylus1.4生活史与繁殖特性三代虫是单殖吸虫中少有的以胎生为繁殖方式的寄生虫，靠鱼类体表和腮部的粘液、分泌物及血液中的混合物为食。雌雄同体，在胚胎发育过程中无休眠期、传播期及中间寄主，被寄生虫专家称为“超生繁殖”。即在第一代发育成熟时体内孕育着第二代，[7]甚至第3～4代，第二代在出生时已经完全成熟并在体内孕育着自己的子代。研究表明，雌性生殖系统比雄性生殖系统发育早，其特征在于子宫体内合胞体的结构，因为子一代[7,43]和子二代不可能和母代在同一体内拥有一套生殖系统。首先母代产生子一代，属于无性繁殖，这被称为“多胚现象”或“幼体繁殖”，然后子一代体内的簇细胞发育形成[43-45]子二代，此时雄性生殖系统发育成熟，所以子二代属于有性繁殖。三代虫通过鱼体之间的相互接触以及水体流动即可传染，24h即可繁殖第二代，并且一个月一个成虫能繁殖一百万个后代，即使离开鱼体在水体中5～10天仍有感染力[16][21]。但三代虫的存活时间会受到粘液影响，在没有粘液的情况下4h以内便会死亡。1.5流行病学及宿主特异性1.5.1分布5 额尔齐斯河鱼类三代虫分类、流行情况及系统发育研究三代虫分布广泛，大西洋、北冰洋沿岸的多个国家和内陆河流都有鱼类被三代虫被[7]感染，国外在波兰，瑞典，丹麦，俄罗斯，挪威等诸多个国家，国内包括新疆、湖南、[39]武汉、东北、江苏等19个省市都有三代虫报道，其中以湖北、广东两省最严重。1.5.2寄主范围三代虫寄主较多，海水鱼和淡水鱼均可感染。研究表明约5%的淡水鱼类感染三代[39]虫，包括鲤科、鲑科、鲈科等养殖鱼类及野生鱼类和名品鱼等，主要寄生于鲤形目，[16-30]尤以鲤科鱼类中较为常见。1.5.3寄生特点1.5.3.1寄生传播方式三代虫主要靠8对边缘小钩配合中央大钩来固定于宿主体表。通常边缘小钩刺入上皮细胞来减小大钩和固着部位的间距，中央大钩在虫体未晃动时大多呈一个角度压迫，虽然施加压力但不穿透上皮细胞，两者将虫体固定在寄生部位，在生存的同时达到损害[7]寄主最小化。周围的边缘小钩和伞状部的乳头状肌肉形成一个吸盘，融合在一起，从而防止虫体松动和从鱼体滑落。虫体依靠小钩的独立移动及乳头状肌肉的收缩进行寄生[44-45]部位的变换，并且通过与头腺配合身体的蜷缩进行“尺蠖式”运动。在张其中南方鲶鱼的三代虫研究中证实古雪夫三代虫（G.gussevi）既可以通过宿主直接接触传播，也可通过间接传播，即使用网将宿主隔开也可以通过水体的流动而感染[24]，因此易在宿主间传播。1.5.3.2寄生部位选择三代虫通常主要寄生在腮部和鳍部及体表，研究表明更喜欢寄生于鳍条，寄生部位有偏好性。Appleby在研究三代虫季节性分布时提到G.callallatis优先感染鳍部和头部[46]，Jensen和MoTA在大西洋鲑三代虫的研究中证实：在同样情况下，和腮部相比寄[47-48]生于鳍条的三代虫更多。同时这种偏好性会因三代虫种类及寄生宿主的不同而有区[49-50]别。1.5.3.3宿主特异性单殖吸虫的宿主专一性研究表明，三代虫科宿主专一性较强，略低于指环虫科和锚6 新疆农业大学硕士学位论文[1]首虫科。这种特性是一种适应能力的表现，与环境的改变和宿主的更换及生物的古老[31-32]性有关，越古老的生物宿主特异性越高。2008年，王艺秀等在总结Harris等的三代[34]虫资料后统计分析了425种三代虫，其中有279种只感染一种宿主，约占65.65%，15.76%感染两种宿主，8.71%种感染三种宿主。同时当宿主感染多种三代虫时，所寄生的三代虫大多都为不同的亚属，所以三代虫的宿主专一性主要表现在种及种以上的级别[34]。1.6生态因素对三代虫的影响研究表明，周围环境的变化、虫种间的竞争、宿主的抵抗力及敏感程度都会影响三代虫的寿命和繁殖能力，从而间接影响三代虫的感染率（Prevalence），感染强度（Intensity），感染丰度（Abundance）等。其中环境因素主要是水环境的温度、盐度、pH、化学因素及水质等；虫种间的竞争主要是生态空间的竞争；宿主因素则多是宿主个[53]体的大小、种类、性别、种群数量及季节性的生殖行为等。1.6.1环境因素影响1.6.1.1水质[52]Koskivaara在研究斜齿鳊（Rutilusrutilus）腮部的寄生虫时对比发现，水质相对污染的体中，鱼类寄生虫种类的多样性和数量较高，这也许是宿主受水质影响抵抗力下[53]降更容易被感染的因素。Dusek在研究寄生虫生物多样性时也证实了这一观点，即三[53]代虫与水体污染后宿主种群数量、抵抗力及水中寄生虫群落有关，因此在水产养殖时水质对寄生虫的滋生起着一定因素。1.6.1.2温度虽然三代虫寿命较短，一只成虫可繁殖1～5代，但24h以内就可以翻一倍，并以[54-55]指数级扩增，所以整体综合繁殖力在单殖吸虫中最高。这种繁殖能力会受到温度的影响和制约，三代虫的胚胎发育对温度很敏感，代代生殖的间隔时间、寿命、生殖率、[54-56]以至于种群的增长速度等都与温度有关，其关系见表1-1。三代虫的最适宜温度为20℃，虽然在温度的影响下，很多因素呈一定的相关性，但7 额尔齐斯河鱼类三代虫分类、流行情况及系统发育研究有一定范围，并且这种温度的敏感性是相对的。如在30℃以后三代虫的生殖能力开始下[7][56]降，Cable的实验记录了G.gasterostei在4℃可存活101h，但15℃只能存活67h；[57]Olstad等在研究大西洋鲑三代虫时，发现其存活时间分别是3℃60h，18℃27h；并且Andersen在研究虹鳟体表的三代虫时发现，温度在18.7℃时出现虫体从宿主寄生部[58]位游离的现象，而在11.6℃、5.5℃没有。因此温度的降低有助于三代虫延长寿命，但也会因虫体种类敏感程度的不同而有别，即寿命延长的同时，繁殖能力会下降，但温[59]度升高，其繁殖生长速度又会加快恢复。HarrisP.D.的研究从遗传生殖的角度证实了这一点，即当温度降低时多为第一代进行无性繁殖，温度较高时多为第二代进行有性生[43,45,60]殖。表1-1温度对三代虫种群动态的影响Tab.1-1TheinfluenceoftemperatureonpopulationecologyofGyrodactylus序号呈负相关呈正相关1后吸器几丁质大小个体生长速度2平均寿命繁殖能力3生殖期的长短和生殖时间种群增长速度1.6.1.3盐度和化学因素盐度对三代虫的生殖和几丁质结构有一定影响。海水盐度相对较低，所以有很多种三代虫可以在海水中生存。并且将生存于淡水中的三代虫转入海水中，在短暂“盐休克”后即可恢复活力。Soleng和Bakke的大西洋鲑三代虫的研究数据中显示，当温度在12℃时盐度影响三代虫繁殖，盐度在5%时三代虫种群数量呈扩增状态，但是在7.5%时56[61]天后三代虫全部灭亡，在20%盐度时仅存活12h，因此不同种类的三代虫对盐度的敏[7]感度不同。有关水中其它因素对三代虫影响的研究比较少。许多淡水中的三代虫种类很难在海[42]水中生存，能在不同盐度中生存的三代虫仅为少数。同时淡水中的三代虫其生物多样性可能会比去离子水中的低。在Pole和Cunningham的研究中表明，地域不同，水域的[62-63]酸碱度、溶氧量、所含矿物质、金属离子等均存在一定差异，同时人为的污染也会[7]影响化学因素的变化。1.6.2宿主免疫学8 新疆农业大学硕士学位论文1.6.2.1宿主免疫反应鱼类宿主自身的免疫反应对三代虫的感染力和繁殖能力有一定的影响。这种免疫反[7]应对三代虫有一定杀伤力，是通过特异性和非特异性反应激活补体系统而产生的。Buchmann指出德氏三代虫（G.derjavini）对C3补体因子比较敏感，导致感染率相对较[64]低。粘液细胞同样有杀伤力，这也许与粘液上皮细胞的结构有关系。Sterud等在研究大[65]西洋鲑三代虫时发现，感染鲑鱼会致使粘液密度会下降，Wells和Cone在研究G.[66]colemanensis感染大马大哈鱼时也发现了同样的问题。Buchmann指出这种粘液有一定杀伤力，宿主免疫反应越强分泌的粘液越多，在感染三代虫时粘液呈先上升后下降的[67]趋势，同时这种粘液杀伤力宿主和三代虫种类不同，机理也不一样。1.6.2.2宿主抗病性Chevassus等在鱼类疾病的抗性遗传中指出，鱼类自身对大多数寄生虫都存在一定[68]的抵抗力，这种抵抗力会随着免疫学的遗传性而逐渐增强，从而产生一定的抗病性。即同种鱼类再次感染的几率或者感染后的感染率会下降，同时虫体给宿主带来的一定范围内的压力损伤，会在逐渐共生的环境中变得适应。1.6.3宿主的因素宿主的遗传特性，体型大小，性别以及发育生殖期会导致体表三代虫数量的一定变化。Tinsley在研究宿主和寄生虫的遗传特性中指出，寄生虫的宿主专一性、敏感性及虫[69]体的种类特征均受到寄生宿主的影响，这会导致寄生虫的种群丰度、种类等参数发生变化。并且在遗传变异性较小的宿主类别中三代虫的感染率等会相对较高，而杂交鱼类[33]的体表寄生的三代虫种类等会相对较少。刘继芳在总结资料时发现，宿主的大小，年龄与单殖吸虫的感染率、感染强度等的影响结果不一，有的认为呈正相关，但也有学者[33]研究数据显示呈负相关。也许寄生虫的种类和宿主自身的体型特型不同，所得结果不同，这还有待进一步研究。宿主的性别和生殖时期也会对寄生虫有一定影响。一般雄性鱼在生殖期由于筑巢等因素会导致体能下降，抵抗力降低，同时会加大寄生虫感染几率。Chris在研究9 额尔齐斯河鱼类三代虫分类、流行情况及系统发育研究[70]Gyrodactylussp.时发现，六月份雌鱼体表三代虫的感染率明显低于雄鱼。1.6.4种群分布与竞争1.6.4.1种群分布22单殖吸虫的分布类型有三种：聚集分布（S/X＞1）、随机分布（S/X=1）、均匀分布2（S/X＜1）。单殖吸虫的研究表明大多数寄生虫属于聚集分布，这种聚集在本质上而言是动态的。影响单殖吸虫种群季节变动的原因诸多，如：气温、含氧量、寄生虫的种类及宿主的特性等。由于三代虫虫体较小，在淡水水域和海水中均可生存，种类较多繁殖迅速，而且存在混合感染的现象，一些生物因素和非生物因素给种类鉴定带来一定困难，[71]所以有关三代虫的种群动态等研究相对较少。三代虫主要对温度比较敏感，所以多以[61]季节性爆发，但同时又受气温和地域的影响，导致季节性有别。三代虫主要分布在30°N～70°N的温带水域，通常5～7月份高发，呈聚集分布。Davidova对G.rhodei流[72]行病学和季节动态做了研究，发现感染率感染强度对着气温的升高而降低。1.6.4.2竞争关系[33]对于单殖吸虫而言，生态位较狭窄，无论是食用资源还是生存空间都是有限的，因此竞争作为一种生态因子显得尤为重要，这有利于物种的优胜略汰，对种群密度起到[73]潜在的调节作用。竞争主要表现在种内竞争和种间竞争，其中种内竞争比种间竞争更重要，它可以使寄生虫之间的生态位变窄，而种间的相互竞争则不会，这主要是寄生虫的宿主专一降低了种间竞争的制约因素。由于寄生虫之间存在差异，所以这种种内竞争[74]会随着种类不同而改变。按照高斯原理，即种与种之间竞争和共生是并存的，同时对于寄生虫寄生系统而言，寄生虫的感染率也不能过高，所以无论是种间竞争还是种内竞[75]争都是相互调节、相互制约的。1.7危害及防治1.7.1危害三代虫靠边缘小钩和中央大钩固着于宿主体表，同时配合“伞状结构”中的乳头状肌肉进行“转圈”移动，每当虫体晃动和做“尺蠖式”运动时都会对表皮造成机械损伤。10 新疆农业大学硕士学位论文三代虫寄生后不断的摄食上皮组织，首先使鱼类表皮布满瘢痕，体表产生一层白色粘液，喜欢在草丛间窜擦；然后逐渐鳍部损伤，运动失调，出现“打弯”、“游窜”、“狂游症”现象；然后腮部充血，分泌大量粘液，鳃小片换氧下降，呼吸受阻，食欲减退，消瘦，抵抗力下降；再者是致病菌导致腮部继发感染，鳃片溃烂，以至于鱼无法正常摄食，出现空肠，游动受阻；严重者细菌随血液到达内脏器官，引起肝脏、肾脏病变，出现腹水，[19-25]最终导致死亡。1.7.2防治1.7.2.1预防一般春季是最佳防治季节。此时三代虫种群开始扩增，鱼类抵抗力较低最容易感染。[18-25,36]预防从养殖的每个阶段都要注意：通常在养殖鱼类入池前将池塘用高锰酸钾消毒，为防止外来鱼将病原带入，在引进鱼苗时对鱼苗用15～20mg/L的高锰酸钾溶液药浴15～30min，进行杀虫；干塘后用漂白粉、生石灰彻底清塘；同时及时定期清除水中的饵料粪便，保持水质清洁，加强饲养管理，降低饲养密度，升高水位，提高宿主尤其是鱼苗的抵抗力；发现病鱼时及时清除，切勿再次感染。1.7.2.1治疗一般镜检一个视野下出现两只三代虫就得治疗。结合前人对三代虫病的防治[2,22,23,36,78-80]，发现主要是采用高锰酸钾、福尔马林、食盐、生石灰等药品用泼洒或者药浴的方法进行治疗。（1）食盐药浴。由于三代虫对盐度教敏感，而且食盐安全无药物残留，对鱼类和工作人员都比较安全。刘遭津在虹鳟三代虫的防治中发现3%～5%的食盐药浴5～15min[23]即可杀死三代虫。不同的鱼食盐浓度和药浴时间不同。考虑到幼鱼等比较敏感的鱼，[22-23,78]一般采用4%的盐药浴40s效果最好。（2）甲醛药浴。白桂芝在细鳞鱼的三代虫病治疗中发现，温度在14℃时0.25%甲[29]醛药浴30min即有疗效。刘遭津等表明，虽然甲醛能导致虫体蛋白质变性，但较贵[23]不建议大面积使用，可用于鱼苗的药浴，0.5%浓度洗浴lmin即可。朱桂生表明病情11 额尔齐斯河鱼类三代虫分类、流行情况及系统发育研究33[30]严重时可用60～70g/m的福尔马林加20～30g/m高锰酸钾药浴7～10min。3（3）甲苯咪唑。陈爱平等建议用浓度为10%甲苯咪唑溶液（0.10～0.15g/m），2000[2]3[30]倍稀释全池泼洒。朱桂生等用0.3～0.8g/m甲苯咪唑原粉药浴36～48h治疗有效。（4）生石灰全池泼洒。生石灰价格便宜使用方便，刘遭津在在虹鳟鱼的三代虫药3物筛选中指出，在2龄的鱼池中按500g/m的量泼洒，每天一次，每次40min两天即[23]可控制病情，5天后鱼恢复正常。（5）阿苯达唑粉饲喂。阿苯达唑和甲苯咪唑是长期以来较为安全有效的广谱驱虫3[2]药，休药期为500度日。可用0.2g/m阿苯达唑粉饲喂，5～7天见效。值得注意的是药浴有必要提前做梯度试验，并且正确计算池塘水中的体积，以免给药浓度不当造成损失。由于三代虫容易反复感染，所以在下药后1～2天配合红霉素、[23,36]土霉素等灭菌药效果更佳。1.8系统发育学研究1.8.1分子系统发育概况1.8.1.1发展历史1950年昆虫学家Hennig首次从理论的基础上提出了分子系统学，1966年以后该理论逐渐被应用到生物系统学、地理学、古生物进化等领域，并引起较大影响。后来随着[79]科学技术的发展与创新，引发了分了系统发育学（Molecularphylogenetics）。该研究从分子角度展现了生物类群的进化关系，弥补了形态学的局限和不足。后来系统发育学应用到寄生虫领域，将分子生物学和形态学两者结合，进行寄生虫的分类和亲缘关系的研究，两者相辅相成，这为单殖吸虫的系统发育学及种类鉴别等相关研究开辟了更好的[7]途径。1.8.1.2系统发育分析方法近年来，DNA检测技术和PCR聚合反应在有关系统发育学中应用比较广发，而且技术成熟。其中对于DNA的系统发育分析，主要是用序列比对和构建分析进化树来进[80,81]行。序列比对通过MAGA、BioEdit软件即可完成，必要时需要手动调整。构建系12 新疆农业大学硕士学位论文统发育树的方法主要有贝叶斯推断法、最大似然法、距离法、最大简约法，使用的方法[82,83]不同，得到的树也不同。1.8.1.3分子标记分子标记技术在分子系统学中应用广泛，主要从遗传学的角度，对核苷酸的组成进行比对分析并进行遗传变异的检测。现如今更多的是以PCR为基础的DNA测序法，该方法通过一些功能基因序列的进化性和保守性来进行种类的区分，更深入的研究物种分类和遗传进化等问题。分子标记中常用主要是线粒体DNA和核糖体DNA，也有对核糖体间隔区IGS的研究，但相对较少。核糖体DNA主要包括编码区和非编码区，其中编码区是18S、5.8S和28SrRNA，该类序列均较为保守；非编码区是指内转录间隔区ITS-1、ITS-2及非转录间隔区NTS。其中5.8S很短，在ITS-1和ITS-2序列之间，所以将内转录间隔区的ITS-1、ITS-2和5.8SrRNA统称为ITS区。该区域序列进化程度较快，在基因组中高度重复，长度较短易于PCR扩增，种内变异小，种间变异大，相对于编码区的序列可以获得更多的变异[84]序列。线粒体是大多真核生物体内一种重要的细胞器，相对于核基因进化更快。虽然分子量不大，但突变率很高，是从能量代谢的角度来研究生物的进化问题，因此在生物学领[85]域应用也很广泛。常用的是COI基因（细胞色素氧化酶I），该基因可用来进行系统发育和DNA编码的研究。但相对而言，在扁形动物门尤其是单殖吸虫的分类系统学研[86-88]究中，应用较多的还是ITS区域。1.8.2三代虫系统发育概况[89]有关寄生虫分子分类学和系统学方法最早开始于1990年早期，用于大西洋鲑三代虫的研究治疗，当时发现传统的形态学方法已经不能准确鉴定，所以Cunningham等[63]首次开始以分子探针为方法，用来鉴别大西洋鲑三代虫和其它三代虫，这对三代虫的分类学意义重大，加快了学者对三代虫种类的研究。1.8.2.1核糖体DNA起初Bakke等选择了高度保守的28SrDNA（V4可变区），该片段的基因易于用通13 额尔齐斯河鱼类三代虫分类、流行情况及系统发育研究[7]用引物扩增。但该片段基因通过扩增后虽然可以将大西洋鲑三代虫与非致病性的鳟三代虫（G.truttae）和德式三代虫（G.derjavini）中区别出来，但却不能区分G.thymalli和G.teuchis，因此存在一定的局限性。于是在1997年Cunningham等发展了以核糖体基因[63]中的内转录间隔区（ITS-1和ITS-2）和5.8SrDNA作为标记基因来进行中的鉴别。Zietara等在三代虫的基因研究中表明5.8SrRNA序列是高度保守的，也许是很好的属以内种类之间鉴别的标记，但该片段太短，信息量有限，不易于单独扩增，所以通常和ITS[90]序列一起作为标记基因。18SrDNA的V4可变区信息量足够但较短，相对不易于扩增。后来发现可变区的rDNAITS序列通常来自非致病性的三代虫种类，且不会因地理[93]区域的改变发生变异，是属级分类的很好的标记方法；通过ITS1序列片段的长短可[90-92]以更好的进行三代虫种间的区分。事实证明了对于三代虫基因组而言，ITS-1和ITS-2比V4可变区更有效，即使是很相似的种也可以通过分子标记序列来鉴别，例如Zietara等报道的稀有三代虫G.rarus和鳃三代虫G.branchicus形态学测量很相似，但ITS分子序列结果显示仅存在0.9～1.3%[92]的差异；大马哈鱼的G.teuchis和非致病性的三代虫种类在没有使用ITS序列鉴定之[93]前都很难区分；G.alexgusevi和江鳕三代虫（G.lotae）、G.jussii和大爪三代虫（G.[92]macronychus）等相似种的类鉴充分体现了ITS序列的优势。到目前已有100多个三[91]代虫种类的ITS序列被测出，这些测量数据对欧亚淡水区域的三代虫种类研究有很大意义。1.8.2.2线粒体细胞色素氧化酶（COI）三代虫的线粒体COI基因相对核糖体基因应用较晚，2002年Meinilä在研究大西洋[94]鲑三代虫时使用了COI基因，用来区别大西洋鲑三代虫和相似种。事实证明COI基因能从能量代谢的角度体现相对更深一层的差异，同时引物制备不受数量限制，可制备多组引物。它的出现开启了三代虫DNA条码技术的研究，所以对于寄生虫而言COI基因的研究时必不可少的，但也存在不足。三代虫COI基因的多样性要比估计值高，仅依据DNA分类条码不能显示全面的信息，如对于致病性和非致病性种类的区分，流行病[7]学等方面的资料显得不足。所以对于三代虫的分类及系统发育研究，核基因应用更广泛，相对更有效。14 新疆农业大学硕士学位论文1.9研究目的及意义近年来，随着水产业的发展，三代虫疾病在我国各养殖区均有发现，开展的研究内[3]容多为三代虫分类、疾病防治及系统发育等，研究区域主要集中在中部和东南部地区，[39]北方区域相对较少。额尔齐斯河（ErgisRiver）（中国段）发源于新疆阿尔泰山南面，自东向西流经中国、哈萨克斯坦、俄罗斯、蒙古，沿途接纳哈巴河等10多条干流后汇集于鄂毕河，是我国唯一一条北冰洋水系的国际性河流，也是新疆的三大河流之一，孕育了许多欧洲系冷水鱼类。共有鱼类35（亚种），如银鲫（CarassiusauratusgibelioBloch）、白斑狗鱼（EsoxluciusLinnaeus）、江鳕（LotalotaLinnaeus）、丁鱥（TincatincaLinnaeus）、河鲈（PercafluviatilisLinnaeus）、鲤（CyprinuscarpioLinnaeus）、东方欧鳊（Abramisbramaorientalis[95]Berg）、粘鲈（AcerinacernuaLinnaeus）等。这些鱼类肉质鲜美且富含营养，经济价值很高，部分已形成规模化养殖。自1986年“引额齐海”工程后，额尔齐斯河与乌伦古[95-96]湖相通，已成为新疆重要的生态屏障和水产业发展的支柱，因此该河流在科学研究上具有重要价值。近几十年来伴随着我国水产业的发展，三代虫病给鱼类养殖带来的经济损失越发严重，对于额额尔齐斯河自然水体鱼类繁殖和土著经济鱼类规模化养殖造成的影响不容忽视。有关额尔齐斯河鱼类寄生虫的致病性、分类学、种群生态学和系统发育等已有相关报道，如指环虫、锚首虫、双身虫、复口吸虫、复殖吸虫、线虫、绦虫等，[75]但对三代虫的相关研究却很少见。本文采取了常规的鱼类调查、统计学、分子生物学方法，对额尔齐斯河水域中鱼类三代虫进行调查研究，进一步明确该河流鱼类体表三代虫的种类以及感染情况，同时结合形态学和分子生物学方法对其种类进行鉴定，进行了系统发育研究，为新疆的水产业发展和我国三代虫的研究提供基础的资料。15 额尔齐斯河鱼类三代虫分类、流行情况及系统发育研究第2章额尔齐斯河鱼类三代虫分类及流行特点三代虫隶属于扁形动物门（Playthelminthes），单殖吸虫纲（Monogenea），胎生，[1]因其母代、子代、孙代三代同体，所以称为三代虫。自1832年首次发现以来，全世界现已报道400余种，其中我国现已发现50余种，约5%的淡水鱼类感染三代虫，主要寄生于鲤形目（Cypriniformes），尤其是鲤科鱼类较为常见。由于该寄生虫主要通过后吸器上的锚钩固着于寄生部位且繁殖迅速，对皮肤和鳃部造成损伤并继发感染，导致鱼类表皮溃烂及烂鳃病等，一直备受国内外学者关注。国外研究涉及了三代虫地理分布、种群生态、进化、亚显微结构、病理病变及病害防治等诸多方面（ISI/WebofScience）；国内各养殖区均发现有三代虫，开展的研究内容多为三代虫种类、疾病防治及系统发育等[3][39]，主要集中在中部和东南部地区，北方相对较少。本研究主要针对额尔齐斯河鱼类寄生的三代虫，该河流发源于阿尔泰山，是我国唯一一个动植物来源于古北界-欧洲西伯利亚亚界的区系地区，物种资源丰富，同时该河横跨欧亚四国，是我国唯一一条北冰洋水系的国际性河流，孕育了许多来源于欧洲区系[95-96]的冷水性鱼类。独特的地理位置以及多元化的物种资源使得该河流备受学者关注[97]。但额尔齐斯河地处我国最西北，有关其流域鱼类寄生虫的相关研究还不全面，本课题组在该流域研究采样时发现有部分鱼有三代虫寄生，并且有的感染较为严重，造成鱼[75]苗大批量死亡。经资料查找发现对该河流三代虫的记载很少。本文通过对额尔齐斯河水域中鱼类的调查，明确额河鱼类三代虫种类，同时了解其寄生特点，为鱼类病害防控积累资料。2.1材料方法2.1.1样品来源自2009年8月至2014年8月，选取额尔齐斯河的北屯镇、185团场、布尔津和哈巴河为采样点，通过随机自捕或者从当地渔民处购买材料鱼（见图2-1）。16 新疆农业大学硕士学位论文图2-1额尔齐斯河水系分布及采样点分布图Fig.2-1DistributionandsampledistributionoftheErgisRiver2.1.2仪器、用具数码相机、普通显微镜、解剖镜、数码摄像显微镜、日立S-540扫描电镜。其它用具:眼科镊、手术剪、手术镊、解剖盘、眼科剪、解剖针、解剖刀、培养皿、载玻片、放大镜、记录本、盖玻片、标签、离心管、标本瓶、滴管、酒精灯、三角锥形瓶、卷尺、硫酸纸等。2.1.3试剂75%酒精、95%酒精、生理盐水、4%聚乙烯醇乳酸酚、苦味酸铵甘油饱和溶液。2.1.4采集保存[98]虫种的采集和保存主要参照《鱼病调查手册》，用解剖针在解剖镜下观察取样，由于三代虫的虫体较小，还需要采取鳃部和体表的粘液压片在显微镜下观察，用移液枪或细玻璃吸管吸取虫体，按宿主和地点的不同分别用75%和90%的酒精固定，装1.5mLEP管中。2.1.5染色制片镜检（1）4%聚乙烯乳酸酚染色法。将单只用75%酒精固定的三代虫虫体，置于干净的17 额尔齐斯河鱼类三代虫分类、流行情况及系统发育研究载玻片上，反复滴加蒸馏水，待酒精挥发后，吸去多余蒸馏水。滴加一滴乳酸酚染液，盖上盖玻片。（2）苦味酸铵染色法。首先将虫体洗干净后至于载玻片（同上），滴10%的SDS溶液一滴，消化1h，同时注意滴加蒸馏水以防SDS晶体析出；然后将SDS溶液吸去（注意以防气泡），用蒸馏水清洗3次；最后吸去多余清水，滴加苦味酸铵甘油饱和液，盖上盖玻片，即可在镜下观察。（3）扫描电镜。首先将虫体洗干净至于95%的酒精中过夜处理；然后按照丙醇酒精4:1、1:1、100%进行梯度脱水，每次30min（注意在梯度过渡时换液不换皿，三代虫较小，以防丢失）；然后CO2临界点干燥5min，粘台镀膜；最后用日立S-540扫描电镜拍摄。2.1.6虫体鉴定与指环虫相比，三代虫的虫体较小且没有眼点，形态鉴别主要依据交配囊和中央大[1,44]钩、边缘小钩及背腹联结棒等几丁质结构的大小和形态来鉴定。2.1.7统计方法（1）寄生虫的感染率（InfectRates）、平均感染强度（MeanInfectionIntensity）、平[99]均感染丰度（Meanahundance）等参考Bush等的定义，详情如下：感染率：感染三代虫的鱼数量/鱼总数量；平均感染强度：平均每尾鱼感染三代虫的数量（不包括未感染的鱼）；平均感染丰度：所有感染三代虫的平均数量（包括未感染的鱼）。222（2）选取方差（S）和均值（X）数据：S/X<1为均匀分布，S/X=1为随机分布，2S/X>1为聚集分布。2.2结果2.2.1额尔齐斯河三代虫名录对额尔齐斯河鱼类寄生三代虫的种类进行形态学鉴定，共计14种，其分类地位如下18 新疆农业大学硕士学位论文（新纪录详情见第3章）：扁形动物门Platyhelminthes单殖吸虫纲MonogeneaBychowsky，1937多钩亚纲PolyonchoineaBychowsky，1937三代虫目GyaodactylideaBychoeky，1937三代虫亚科GyrodactylinaeVanBenedenetHesse，1863三代虫属GyrodactylusNordmann，1832（1）细鳞鲑三代虫GyrodoctylubrachymystacisErgens，1978（图2-2）宿主和寄生部位：金鳟、虹鳟（Oncorhynchusmykiss），体表；采集地点：采集地点：额尔齐斯河（中国段）北屯、阿勒泰；时间：2012年7月，2014年7月。A中央大钩（Anchor）；B边缘小钩（Marginalhook）；C交配囊（Cirruspouch）图2-2细鳞鲑三代虫Fig.2-2GyrodoctylubrachymystacisErgens,1978（2）白斑狗鱼三代虫GyrodoctylusluciiKulakowskaja，1951（图2-3）宿主和寄生部位：白斑狗鱼（EsoxluciusLinnaeus），体表；地点：额尔齐斯河（中国段）北屯；采集时间:2013年4月～2014年7月。19 额尔齐斯河鱼类三代虫分类、流行情况及系统发育研究A中央大钩（Anchor）；B边缘小钩（Marginalhook）；C交配囊（Cirruspouch）图2-3白斑狗鱼三代虫Fig.2-3GyrodoctylusluciiKulakowskaja,1951（3）丁鱥三代虫GyrodactylustincaMalmberg，1957（图2-4，新纪录）宿主和寄生部位：丁鱥（TincatincaLinnaeus），体表；地点：在额尔齐斯河（中国段）北屯；采集时间：2012年7月。A中央大钩（Anchor）；B边缘小钩（Marginalhook）；C交配囊（Cirruspouch）图2-4丁鱥三代虫Fig.2-4GyrodactylustincaMalmberg,1957（4）秀丽三代虫GyrodoctyluselegansNordman，1832（图2-5）宿主和寄生部位：银鲫（CarassiusauratusgibelioBloch）、东方欧鳊（AbramisbramaorientalisBerg），鳃；采集地点：采集地点：额尔齐斯河（中国段）北屯、阿勒泰；时间：2012年7月，2013年4月，2014年7月。20 新疆农业大学硕士学位论文A中央大钩（Anchor）；B边缘小钩（Marginalhook）；C交配囊（Cirruspouch）图2-5秀丽三代虫Fig.2-5GyrodoctyluselegansNordman,1832（5）普氏三代虫GyrodactylusprostateErergns，1963（图2-6）宿主和寄生部位：粘鲈（AcerinacernuaLinnaeus），体表；采集地点：地点在额尔齐斯河（中国段）哈巴河；时间：2013年3月，2014年7月。A中央大钩（Anchor）；B边缘小钩（Marginalhook）；C交配囊（Cirruspouch）图2-6普氏三代虫Fig.2-6GyrodactylusprostateErergns,1963（6）马氏三代虫GyrodactylusmarkakulensisGvosdev，1950（图2-7，新纪录）宿主和寄生部位：尖鳍鮈（GobiogobioacutipinnatusMen’schikov），体表；采集地点：地点在额尔齐斯河（中国段）哈巴河；时间：2013年3月，2014年7月。21 额尔齐斯河鱼类三代虫分类、流行情况及系统发育研究A中央大钩（Anchor）；B边缘小钩（Marginalhook）；C交配囊（Cirruspouch）图2-7马氏三代虫Fig.2-7GyrodactylusmarkakulensisGvosdev,1950（7）鮈三代虫GyrodoctylusgobionumGussev，1955（图2-8）宿主和寄生部位：棒花（AbbottinarivularisBasilewsky），鳃；地点：额尔齐斯河（中国段）北屯；采集时间：采集时间:2013年4月～2014年7月。A中央大钩（Anchor）；B边缘小钩（Marginalhook）；C交配囊（Cirruspouch）图2-8鮈三代虫Fig.2-8GyrodoctylusgobionumGussev,1955（8）中型三代虫GyrodoctylusmediumKathariner，1893（图2-9）宿主和寄生部位：鲤（CyprinuscarpioLinnaeus）、银鲫（CarassiusauratusgibelioBloch）、散鳞镜鲤（C.carpiohaematopterrus），体表、鳃；地点：在额尔齐斯河（中国段）北屯、哈巴河；采集时间：2012年7月；2013年4月；2014年7月。22 新疆农业大学硕士学位论文A中央大钩（Anchor）；B边缘小钩（Marginalhook）；C交配囊（Cirruspouch）图2-9中型三代虫Fig.2-9GyrodoctylusmediumKathariner,1893（9）鲤三代虫GyrodoctyluscypriniDiarova，1964（图2-10）宿主和寄生部位：鲤鱼（CyprinuscarpioLinnaeus），鳃；地点：额尔齐斯河（中国段）北屯、哈巴河；采集时间:2013年4月～2014年7月。A中央大钩（Anchor）；B边缘小钩（Marginalhook）；C交配囊（Cirruspouch）图2-10鲤三代虫Fig.2-10GyrodoctyluscypriniDiarova,1964（10）细锚三代虫（史若兰三代虫）GyrodoctylussprostonaeLing，1962（图2-11）宿主和寄生部位：银鲫（CarassiusauratusgibelioBloch）、鲤（CyprinuscarpioLinnaeus），鳃和体表；采集地点：额尔齐斯河（中国段）北屯、哈巴河；时间：2012年7月，2013年4月，2014年7月。23 额尔齐斯河鱼类三代虫分类、流行情况及系统发育研究A中央大钩（Anchor）；B边缘小钩（Marginalhook）；C交配囊（Cirruspouch）图2-11细锚三代虫Fig.2-11GyrodoctylussprostonaeLing,1962（11）江鳕三代虫GyrodoctyluslotaeGussev，1953（图2-12）宿主和寄生部位：江鳕（LotalotaLinnaeus），体表；地点：额尔齐斯河（中国段）北屯；采集时间：采集时间:2013年4月～2014年7月。A中央大钩（Anchor）；B边缘小钩（Marginalhook）；C交配囊（Cirruspouch）图2-12江鳕三代虫Fig.2-12GyrodoctyluslotaeGussev,1953（12）梭鲈三代虫GyrodoctylusluciopercaeGusev，1962（图2-13，新纪录）宿主和寄生部位：粘鲈（AcerinacernuaLinnaeus），体表；采集地点：额尔齐斯河（中国段）北屯、哈巴河；时间：2012年7月，2013年4月，2014年7月。24 新疆农业大学硕士学位论文A中央大钩（Anchor）；B边缘小钩（Marginalhook）；C交配囊（Cirruspouch）图2-13梭鲈三代虫Fig.2-13GyrodoctyluluciopercaeGusev,1962（13）三代虫未定种1宿主和寄生部位：湖拟鲤（RutilusrutiluslacustrisPallas）体表；采集地点：额尔齐斯河（中国段）北屯、哈巴河；时间：2012年7月，2014年7月。（14）三代虫未定种2宿主和寄生部位：河鲈（PercafluviatilisLinnaeus）体表；采集地点：额尔齐斯河（中国段）北屯、哈巴河；时间：2012年7月，2014年7月。2.2.2鱼类三代虫感染情况自2011年开始对额尔齐斯河鱼类三代虫感染情况进行调查，剖检鱼1688尾，有16种鱼感染三代虫，隶属于4目、5科、13属。三代虫总感染率为5.27%（89/1688），其中感染率最高为鲤（23.94%），最低的为河鲈（0.74%）；除东方欧鳊和鲤外，其余的感染率均不超过10%，平均感染强度、感染丰度最高的为散鳞镜鲤中型三代虫（18.000±11.827）、（2.250±11.827），最低为丁鱥三代虫（1.000±0.087）、（1.000±0.087）。2鲤、散鳞镜鲤、银鲫感染三代虫的方均比（S/X）都大于1，呈聚集分布，其余的小于1。详见表3-1。不同宿主感染三代虫的种类数量不同，大多数宿主只感染1种三代虫，也有同时感染2～4种的情况，如粘鲈、鲤和银鲫；也有1种三代虫寄生多种宿主的现象，如普氏三25 额尔齐斯河鱼类三代虫分类、流行情况及系统发育研究代虫既可以寄生于高体雅罗鱼，也可以寄生贝加尔雅罗鱼和粘鲈，细锚三代虫和中型三代虫均可以寄生于银鲫和鲤。此次研究采集的29种鱼类中，未见三代虫感染的鱼类有北极茴鱼（Thmallusarcticusarcticus）、北极红点鲑（Salvelinusleucomaenis）、麦穗鱼（Pseudorasboraparva）、鲢（Hypophthalmichthysmolitrix）、鳙（Hypophthalmichthysnobilis）、北方须鳅（Barbatulabarbatulanuda）、新疆高原鳅（Triplophysastrauchii）、小体高原鳅（Riplophysaminut）、北方花鳅（CobitisgianoeiRendahl）、梭鲈（LuciopercaLucioperca）、黄黝鱼（Hypseleotrisswinhonis）、杜父鱼（Cottuspollux）以及阿勒泰真鱥（Phoxinusphoxinusujmonesis）。表2-1额尔齐斯河三代虫种类及感染情况Tab.2-1ThespeciesandinfectionofgyrodactylusinErgisRiver种采集感染感染感染平均感染平均感染2宿主感染种类S/X数尾数尾数率%强度强度丰度虹鳟、金鳟1细鳞鲑三代虫8056.253-102.100±0.0820.061±0.5060.281白斑狗鱼1白斑狗鱼三代虫9533.11-21.333±0.2000.042±0.2000.030丁鱥1丁鱥三代虫6811.471-51.000±0.0870.007±0.0860.007东方欧鳊1秀丽三代虫1651610.262-792.667±0.5830.103±0.5830.127贝加雅罗鱼1普氏三代虫9033.331-21.333±0.2560.044±0.2560.049高体雅罗鱼1普氏三代虫9033.331-22.000±0.3862.000±0.3850.074尖鳍鮈1马氏三代虫15142.651-32.250±0.3810.060±0.3810.065棒花1鮈类三代虫3812.6311.000±0.1560.026±0.1580.025中型三代虫鲤3鲤三代虫711723.941-237.250±3.7450.935±3.7551.935细锚三代虫散鳞镜鲤1中型三代虫32412.51-6718.000±11.8272.25±11.8277.771秀丽三代虫细锚三代虫银鲫4144314.191-134.190±2.3200.784±2.3201.285中型三代虫鲤三代虫江鳕1江鳕三代虫4512.2221.000±0.1490.022±0.1490.02226 新疆农业大学硕士学位论文梭鲈三代虫粘鲈28555.881-61.800±0.6800.118±0.6800.257普氏三代虫湖拟鲤1三代虫未定种113221.513-54.000±0.5060.061±0.5060.064河鲈1三代虫未定种213510.7411.000±0.0860.070±0.0860.0072.3讨论我国最早于1948年在鲫鱼的体表发现了秀丽三代虫，相比国外晚了近100年。研究[19-24]主要集中在中部和东南部地区的鲤科、鲑科、鳅科、名品鱼等。有关额尔齐斯河（中[95]国段）的研究国外学者未曾涉及，国内自新中国成立之后才逐渐开始；由于其位于我国最西北，渔业发展相对内地较缓慢，并且三代虫采集与鉴定相对于其它单殖吸虫较为困难，截至到2012年，公开发表的文章中记载新疆额尔齐斯河三代虫只有2种，还需要[39]进一步补充。通过普氏三代虫的光学显微镜和电镜染色对比发现，扫描电镜的虫体外部的大钩钩尖、小钩钩尖、背联结片、复联结片形态更形象立体；经苦味酸铵染色压片虫体的交配囊、小钩、腹联结片，相对乳酸酚染色更清晰，测量更精确；经乳酸酚染色的三代虫虫体整体形态、大钩较为清楚，所以有必要结合染三种染色法对三代虫形态进行全面观察。本次研究共发现寄生于额尔齐斯河（中国段）鱼类的三代虫有14种（2个未定种），均隶属于三代虫属，其中秀丽三代虫、江鳕三代虫、普氏三代虫在额尔齐斯河鱼类寄生[1,75]资料有记载，其余的很少见报道。秀丽三代虫、细锚三代虫、鲤三代虫、细鳞鲑三代虫、中型三代虫在内地报道较多，白斑狗鱼三代虫、梭鲈三代虫、马氏三代虫、丁鱥三代虫还是第一次发现。本次研究表明，鲤、东方欧鳊、银鲫比较容易感染三代虫，感染率和感染强度相对较高，呈聚集分布；丁鱥、粘鲈、河鲈、白斑狗鱼、江鳕均感染较少，呈均匀分布；这些与额河的鱼类组成及宿主的自身特性密切相关，额尔齐斯河属天然水域，鱼类密度低，其自身抵抗力较人工养殖抵抗力强，所以部分鱼类的三代虫感染率较低，但伴随着渔业发展，以外来种东方欧鳊、鲤以及本土白斑狗鱼、银鲫为代表的鱼类已经逐渐形成规模[97,100]化养殖，进一步扩增了这几种宿主鱼类的数量，这给其体表寄生的三代虫生长发育27 额尔齐斯河鱼类三代虫分类、流行情况及系统发育研究创造了有利条件，导致感染率更高；在“南水北调”和“引额齐海”工程后，鱼类洄游通道[100-101]部分受阻，使得北极茴等鱼类数量较少；伴随着鱼类捕捞量的增加以及水环境质量的变化，梭鲈等土著鱼类数量下降，部分鱼类三代虫感染率较低或者未见感染，这与本次对三代虫的研究情况相符。单殖吸虫生态位较窄，寄生虫之间存在生态竞争，这在种内和种间都存在，主要体[31]现在生存空间和食物粘液的竞争，同时又在一定程度上存在动态平衡，以至于大多数三代虫感染率较低，呈均匀分布。如鲤可以感染中型三代虫、鲤三代虫、细锚三代虫，这些同一宿主体表的三代虫之间会存在竞争；采样时也在银鲫体表同时发现细锚三代虫、坏鳃指环虫，在欧鳊鳃部同时发现秀丽三代虫、温氏指环虫和奇异双身虫等多种寄生虫感染同一宿主的现象，虽然存在种间竞争，但可以共存；Rohde认为对于确定生态[102]位而言，种内关系比种间关系的影响因素更大。单殖吸虫宿主专一性较强，虽然三代虫是成虫和幼虫直接在宿主间传播，但其宿主专一性低于指环虫科和锚首虫科。有研究表明，三代虫宿主专一性分别是53.85%（23个样本）、73.7%（319个样本），有多宿主寄生现象，但不会超过7个，并且58.97%的三代虫其寄生宿主仅为1属，94.8%的三代虫其寄生宿主在3属以内，这也许与虫体的进化[31,51]程度有关。本次结果与以上研究基本相符，大多数三代虫只寄生1种宿主，也有同时寄生2种或3种宿主，其次也有同一宿主感染2种三代虫的现象，这些与三代虫及宿主的地域分布和样本数量有很大关系。资料显示越古老的寄主宿主特异性越强，适应能力越强，三代虫是单殖吸虫中少有的胎生繁殖，其既可以寄生于鳃部，也可以寄生于体表，并直接通过宿主接触完成其种群间的传播，是单殖吸虫中较古老的类群，因此三代虫常被用来研究[31]解决单殖吸虫的系统进化和寄主的系统分类问题。而额尔齐斯河流域地理位置特殊，是我国唯一一个动植物来源于古北界-欧洲西伯利亚亚界的区系地区，因此有关三代虫宿主专一性等相关方面的研究对地区的物种进化以及动物地理有一定意义。28 新疆农业大学硕士学位论文第3章中国三代虫属4新纪录种的记述额尔齐斯河地处我国最西北，为欧亚腹地的中心，发源于中国新疆维吾尔自治区阿尔泰山南麓，自东向西流经中国、哈萨克斯坦、俄罗斯，进人斋桑泊，汇集鄂毕河，流人北冰洋，是我国唯一一条北冰洋水系的国际性河流，也是我国淡水鱼中来源于欧洲区[95]系的鱼类种质资源库，孕育了许多欧洲系冷水鱼类，在科学研究上有重要价值。结合资料表明，额尔齐斯河流域共有鱼类36（亚）种，隶属于6目、12科、30属；土著鱼类23（亚种），如：白斑狗鱼、丁鱥、尖鳍鮈、粘鲈等均为其代表鱼类。其中白斑狗鱼隶属于鲑形目（Salmoniformes），狗鱼科（Esocidae），狗鱼属（EsoxLinnaeus）；丁鱥隶属于鲤形目（Cypriniformes），丁鱥属（Tinca）；尖鳍鮈属于鲤形目（Cypriniformes）鲤亚科，鮈属（Gobio）；粘鲈属于鲈形目（Perciformes），鲈科（Percidae），粘鲈属（Acerina）。尖鳍鮈、粘鲈为小型鱼类，其余两种为大型鱼类，目前这四种鱼冷水系鱼类仅见于额尔[95,97]齐斯河及其付水体。其中白斑狗鱼、丁鱥作为冷水典型经济鱼类，味美价格高，所以有关其人工繁殖实验一直备受关注。在2011年8月至2014年8月期间我们在额尔齐斯河（中国段）采样发现了这几种鱼体表的三代虫，均隶属于三代虫科Gyrodoctylidae，[103]三代虫属Gyrodactylus，上世纪50年代左右前苏联记述了这4种三代虫，据资料检[1,4,39,75]索，这四种种三代虫在我国未见报道，由此确定为中国单殖吸虫三代虫属种的新纪录，主要情况如下。3.1材料方法宿主均采自额尔齐斯河（中国段）边境水域哈巴河县附近（见图2-1），参照《鱼病[98]调查手册》对宿主体表和鳃部的黏液进行取样，在解剖镜和显微镜下观察后挑取虫体，经75%酒精固定，用4%聚乙烯乳酸酚或苦味酸铵染色制作标本（所有标本现保存于新疆农业大学动物医学学院寄生虫标本实验室）。种的鉴定参照Malmberg和《中国动物志》[1,42]的三代虫形态学分类方法，在显微镜下测量并绘图，量度单位以mm计算，主要通过交配囊、中央大钩、边缘小钩和背腹联结片等几丁质结构的大小和形态来鉴定。29 额尔齐斯河鱼类三代虫分类、流行情况及系统发育研究3.2结果白斑狗鱼、丁鱥、粘鲈、尖鳍鮈均为额尔齐斯河土著鱼类，其体表三代虫在我国至今未见报道。经形态测量（单位mm）并绘图（图3-1～3-4），并与国内外该类宿主体表的三代虫进行比对（表3-1），发现与其它三代虫存在明显差异，而与俄罗斯报道的该类宿主体表的三代虫为同一种，确定以下4种为我国三代虫属的新种纪录。3.2.1白斑狗鱼三代虫GyrodoctylusluciiKulakowskaja，1951宿主为白斑狗鱼，寄生部位为体表；采集时间为2013年4月，地点在额尔齐斯河（中国段）北屯；感染率为1.51%，感染强度1。形态特征（见图2-3）（依据3个标本描述）：虫体为长叶形，全长0.360。边缘小钩全长0.030～0.039，钩柄长0.032～0.033，钩体长0.006～0.007。中央大钩全长0.075～0.078，基部长0.058～0.063，钩尖长0.033～0.036，内突较厚长0.016～0.028，沟拐角41°～58°。腹联结片大小0.006～0.013×0.035～0.031，棒裙高0.014～0.021。背联结片大小0.001～0.003×0.017～0.035，交配囊呈卵圆形，可见一个明显的大刺，两个中刺，六个小刺。3.2.2丁鱥三代虫GyrodactylustincaMalmberg，1957宿主为丁鱥，寄生部位为体表；采集时间为2012年7月，地点在额尔齐斯河（中国段）北屯；感染率为1.47%，感染强度1～5。形态特征（见图2-4）（依据1个标本描述）：虫体全长0.490，边缘小钩全长0.030，钩柄长0.025，钩体长0.006。中央大钩全长0.053，基部长0.041，钩尖长0.027，内突长0.013。腹联结棒大小0.005～0.009×0.023～0.030，棒裙高0.013～0.018。背联结片大小0.001～0.003×0.016～0.028，交配囊呈卵圆形，有一个弯曲的大刺和六个中小型刺。3.2.3马氏三代虫GyrodactylusmarkakulensisGvosdev，1950寄生宿主为尖鳍鮈，部位为体表；采集时间为2014年7月，地点在额尔齐斯河（中国段）哈巴河；感染率为2.65%，感染强度1～3。30 新疆农业大学硕士学位论文形态特征（图2-7）（依据2个标本描述）：虫体全长0.350～0.600。边缘小钩全长0.024～0.028，钩柄长0.018～0.023，钩体长0.005～0.007。中央大钩全长0.062，基部长0.041～0.046，钩尖长0.029，内突长0.016～0.022。腹联结片略呈长方形，前缘微向前凸，大小0.007～0.011×0.013～0.017，棒裙高0.010～0.020。背联结片大小0.002～0.004×0.06～0.011，交配囊呈球形，见一个明显的大刺，若干个小刺。3.2.4梭鲈三代虫GyrodoctyluluciopercaeGusev，1962宿主为粘鲈，寄生部位为体表；采集时间为2012年7月，地点在额尔齐斯河（中国段）北屯；感染率5.85%，感染强度1～6。形态特征（图2-13）（依据7个标本描述）：虫体全长0.410～0.590，体宽0.094～0.295，咽0.018～0.043×0.017～0.031。边缘小钩全长0.032～0.038，钩柄长0.026～0.029，钩体长0.006～0.007。中央大钩全长0.066～0.079，基部长0.056～0.060，钩尖长0.030～0.036，内突长0.015～0.029。腹联结片大小0.007～0.008×0.031～0.033，耳状突明显，长0.05，棒裙高0.013～0.019。背联结片大小0.002～0.006×0.028～0.029。交配囊卵圆形，明显可见一个弯曲的大刺，两个中小型刺，四个小刺，大小0.015～0.013。31 额尔齐斯河鱼类三代虫分类、流行情况及系统发育研究表3-14种三代虫新纪录种的形态结构数据与其相似种的比较Tab.3-1ComparedthemeasurementsforfournewlyrecordedspeciesofGyrodactyluswithsimilarspecies马氏三代虫鮈三代虫白斑狗鱼三拱形三代虫丁鱥三代虫刺鱼三代虫粘鲈三代虫梭鲈三代虫普氏三代虫种名G.markakulensiG.代虫G.luciiG.arcuatusG.tincaG.gasterosteiG.cernuaeG.luciopercaeG.prostatesgobionum宿主白斑狗鱼白斑狗鱼丁鱥丁鱥尖鳍鮈尖鳍鮈粘鲈粘鲈雅罗鱼虫体全长0.3600.260～0.4600.4900.550～0.9500.350～0.6000.3000.500～0.9000.410～0.5900.300～0.600边缘小0.030～0.0390.020～0.0240.0300.027～0.0370.024～0.0280.2400.026～0.0350.032～0.0380.024～0.030钩长钩柄长0.032～0.033—0.025—0.018～0.0230.005—0.026～0.0290.007～0.008钩体长0.006～0.0070.006～0.0080.0060.006～0.0080.005～0.0070.0510.005～0.0070.006～0.0070.044～0.060中央大0.075～0.0780.031～0.0460.0530.053～0.0700.0620.0370.051～0.0700.066-0.0790.034～0.044钩长基部长0.058～0.0630.024～0.0330.0410.040～0.0520.041～0.0460.0260.039～0.0530.056～0.060.034～0.044钩尖长0.033～0.0360.015～0.0200.0270.026～0.0350.0290.0100.021～0.0300.03～0.0360.020～0.030内突长0.016～0.0280.007～0.0140.0130.015～0.0230.016～0.0220.1600.017～0.0280.015～0.0290.020～0.0300.006～0.013×0.003～0.005×0.005～0.009×0.005～0.008×0.007～0.011×0.006×0.010.005～0.008×0.007～0.008×0.004～0.007×腹联结片0.035～0.0310.012～0.0240.023～0.0300.028～0.0310.013～0.01770.023～0.0280.031～0.0330.015～0.019裙棒0.014～0.0210.010～0.0170.013～0.0180.011～0.0190.010～0.0200.0120.012～0.0170.013～0.0190.012～0.0160.001～0.003×0.001～0.002×0.001～0.003×0.002～0.003×0.002～0.004×0.002×0.010.001～0.003×0.002～0.006×0.002～0.003×背联结片0.017～0.0350.012～0.0210.016～0.0280.020～0.0300.06～0.01170.020～0.0240.028～0.0290.090～0.011卵圆形；1个大卵圆形；1大卵圆形；1大刺球形，1个大1个大刺，51个大刺和81个大刺，11交配囊刺，2中刺，6——刺，2中小刺，和6中小型刺刺，若干小刺个中小刺个小刺个中小刺个小刺4小刺注：①表中数据单位为mm；②“—”表示原始资料中未记载。Note:①Datainthetableareinmm;②"—"Representationoftheoriginaldataisnotrecorded.32 新疆农业大学硕士学位论文3.3讨论白斑狗鱼三代虫、丁鱥三代虫、马氏三代虫和梭鲈三代虫均为国内首次发现，与俄罗斯已发现的为同种。额尔齐斯河地处我国西北，流经多个国家，其独特的地理位置、气候条件和水域生态环境使得其鱼类资源和寄生虫种类有别于国内其它河流，而与欧洲[95,97]和中亚地区极为相似，同时也略有差异。我国位于额尔齐斯河上游，在一定条件下，北冰洋水系鱼类携带的寄生虫有可能由于鱼类洄游产卵等原因在上游出现，因此其寄生虫的种类具有很高的一致性。白斑狗鱼、丁鱥、尖鳍鮈、粘鲈均为我国与俄罗斯共有鱼类，并且在我国仅见于额[95]尔齐斯河流域。虽然近几年我国有新的三代虫种类发现，但发现地区多为内陆，有关北方区域尤其是额尔齐斯河的三代虫研究较少。资料显示赵江山曾报道了一新纪录种—[75]普氏三代虫，《中国动物志》对新疆发现尖鳍鮈体表的鮈三代虫进行了描述，未见尖[1]鳍鮈体表的马氏三代虫，在贺怀亚2012年总结的我国三代虫的种类中未见这几种三代[39]虫记载。经资料查阅确认这四种三代虫是国内首次发现，这对丰富我国三代虫种类有一定意义。由表3-1发现，四种三代虫新纪录种与其它相似种有共同宿主，分别是白斑狗鱼、丁鱥、尖鳍鮈、粘鲈，主要分布在我国额尔齐斯河流域、哈萨克斯坦以及俄罗斯远东地[95]区，而这些宿主在我国内陆水体中未见出现，在宿主方面具有独特性；其几丁质的形态结构存在差异，如白斑狗鱼三代虫与拱形三代虫的中央大钩、基部、钩尖、内突等均有明显差异，其中前者的中央大钩和内突约为后者的2倍，且从形态图（见第二章）中发现白斑狗鱼三代虫的大钩明显比拱形三代虫粗壮，马氏三代虫的钩柄长是鮈三代虫的3～4倍，背联结片也宽很多；粘鲈三代虫与梭鲈三代虫、普氏三代虫交配囊刺的形态数量不同。就这几种相似种而言，其中央大钩、小钩、背联结片、交配囊中刺的数量等都有明显差异，由此可以确定白斑狗鱼三代虫、丁鱥三代虫、马氏三代虫、梭鲈三代虫为新纪录种。33 额尔齐斯河鱼类三代虫分类、流行情况及系统发育研究第4章额尔齐斯河部分鱼类三代虫种类鉴定及系统发育研究[1]三代虫隶属于于单殖吸虫纲，是单殖吸虫中少有的以胎生为繁殖方式的古老类群。可同时寄生于体表和腮部，繁殖以指数级数量扩增，容易大面积爆发，尤其对鱼苗的繁育影响较大，易造成鱼苗大批量死亡。据报道大西洋鲑三代虫G.salaris仅两年就使挪[7,14]威野生大西洋鲑科鱼幼鱼数量下降了50％，因此对养殖业有一定危害。自1832年[39][42]至今全世界现报道400余种，鉴定主要依据Malmberg提供的几丁质结构测量法。就三代虫形态学而言，部分种与种之间较为相似，温度和地理位置等因素的变化有可能[32]导致形态的不同，这给部分三代虫的种类鉴定带来一定困难，需要借助分子手段进行[63]有效鉴定。三代虫分子鉴定最早始于20世纪90年代大西洋鲑三代虫G.salaris的研究，随后出现28SrRNA、5.8SrRNA高度保守区域序列标记方法，后来发展到用内转录间隔[7,63,38]区ITS-1、ITS-2来进行种类区分，并表明了ITS序列的有效性。本研究主要针对额尔齐斯河鱼类寄生的三代虫，该河流发源于阿尔泰山，是我国唯一一个动植物来源于古北界-欧洲西伯利亚亚界的区系地区，物种资源丰富，同时该河横跨欧亚四国，是我国唯一一条北冰洋水系的国际性河流，孕育了许多来源于欧洲区系[95,97]的冷水性鱼类。独特的地理位置以及多元化的物种资源使得该河流备受学者关注[101]。但额尔齐斯河地处我国最西北，有关其流域鱼类寄生虫的相关研究还不全面，本课题组在该流域研究采样时发现有部分鱼有三代虫寄生，并且有的感染较为严重，造成[75]鱼苗大批量死亡。经资料查找发现对该河流三代虫的记载很少，所以本文对额尔齐斯河三代虫种类及其相关系统发育进行研究，无论是从对生态环境还是生物多样性角度，[100]还是对当地水产养殖业及水利工程方面，都起着重要作用，同时也可以进一步为我国三代虫相关研究提供资料，为国内外单殖吸虫的研究提供理论依据。本文结合形态学和分子生物学方法对额尔齐斯河采样的部分三代虫进行鉴定，并通过ITS序列对其系统发育进一步研究。34 新疆农业大学硕士学位论文4.1材料和方法4.1.1材料来源银鲫、东方欧鳊、粘鲈、金鳟均采自额尔齐斯河（中国段）边境水域哈巴河县附近，用刀片轻轻刮取宿主体表和鳃部的黏液进行取样，在解剖镜和显微镜下观察后挑取虫[98]体，经95%的酒精固定后装入1.5mL离心管中，获得三代虫样本。4.1.2基因的提取及PCR扩增选取95%固定的四种宿主体表的三代虫各10只，每只作为一个样品装入1.5mL的EP管，无菌水清洗，TE缓冲液过夜浸泡，参照生工软体动物DNA试剂盒进行DNA提取，-20℃保存。[63]参照Cunninghan等，以ITS1-5.8S-ITS2序列扩增引物，序列如下：BD1：5'-TTTCCGTAGGTGAACCT-3'；BD2：5'-TCCTCCGCTTAGTGATA-3'；由上海生工合成。PCR反映体系为50μL，各物质及其体积见图4-1。反应条件经优化后为94℃预变性5min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸1min30s，35个循环；72℃延伸10min，至于4℃。表4-1PCR反应体系Tab.4-1PCRreactionsystem物质体积10×TaqMasterMix25μL上游引物（10mmol/L）2μL下游引物（10mmol/L）2μLDNA模板2μL双蒸水19μL4.1.3目的基因的测定将扩增产物经1%琼脂糖电泳分析，得到目的条带切胶后用OMEGA公司的胶回收试剂盒进行纯化，纯化产物连接到pEASY-T1载体进行TA克隆，经DH5α感受态细胞转化后，用Transgen公司的EasyPurePlasmidMiniPrepKit提取质粒DNA，然后选取阳性质粒，送到上海生工测序。用Blast对所测的多重序列进行比对，选取短钩伪指环虫Pseudodactylogyrusbini为外类群，用MEGA5.0软件邻接法构建ITS1-5.8S-ITS2分子进35 额尔齐斯河鱼类三代虫分类、流行情况及系统发育研究化树。（所用序列见表4-2）表4-2实验所用和参考的单殖吸虫的种类及序列信息Tab.4-2ThespeciesandsequenceinformationofMonogeneaninexperiment亚属三代虫GenBank登录号SubgenusGyrodactylusspp.AccessionnumberG.brachymystacis-1GQ368237G.brachymystacis-2*KP325622G.salarisAJ515912G.derjaviniDQ355975G.luciiEF446741G.luciopercaeAF484541G.cernuaeAF484529LimnonephrotusG.parvaeEF450249G.GurleyiKC922453G.LongoacuminatusKC922451G.kobayashiiKC922452G.sprostonae-1AY278044G.sprostonae-2*KP295469G.eyipayipiFJ040184G.robustusAY278040MetanephrotusG.flesiAY278039G.branchicusAY338451MesonephrotusG.arcuatusAF156668G.jennyaeBelgiumEU678357G.phoxiniAY278037G.prostae-1AY278038GyrodactylusG.prostae-2*AY278038G.elegans-1AY278034G.elegans-2*KP325623PseudodactylogyrusbiniPseudodactylogyrusbiniGQ478307注：*为本次实验所得序列，其它为GenBank中参考的序列*Thesequence-basedexperiments,theotherforthereferencesequenceinGenBank4.2结果4.2.1四种三代虫ITS1-5.8S-ITS2序列分析36 新疆农业大学硕士学位论文实验所得四种虫体ITS1-5.8S-ITS2rDNA片段，经PCR扩增后条带与形态鉴定一致。经测序得出序列后，分别与GenBank中的三代虫序列进行比对，详情如下：四种三代虫的基因序列如图4-3。其中细锚三代虫目的片段长1197bp，同源性99.66%（1158/1162），GC含量43.61%，有一个突变位点，获得基因登录号KP295469；秀丽三代虫目的片段长921bp，同源性99.89%（885/886），有一个碱基位点的突变，GC含量44.5%，获得基因登录号KP325623；普氏三代虫目的片段921bp，同源性99.34%（915/921），GC含量44.84%，有一个突变位点，获得基因登录号KP295468；细鳞鲑三代虫目的片段长1282bp，同源性99.58%（1195/1200），GC含量44.54%，获得基因登录号KP325622。普氏三代虫与秀丽三代虫较为相似，在140bp、712bp、882bp处不同，这三个碱基分别处于ITS-1、ITS-2、28S序列区域，同源性为99.67%（918/921），其同源性比较见图4-4。4.2.2四种三代虫ITS1-5.8S-ITS2遗传距离分析遗传距离矩阵显示（见图4-5），分析所用的三代虫遗传距离在0.001～0.505之间，种与种之间较为相近。本实验采自额尔齐斯河的细锚三代虫、秀丽三代虫与波兰发现的细锚三代虫、秀丽三代虫遗传距离均为0.001；秀丽三代虫与普氏三代虫极为相近为0.001；细鳞鲑三代虫与波兰的为0.003；Limnonephrotus亚属的遗传距离在0.001～0.158之间，进一步说明了其分类地位。4.2.3三代虫系统进化树运用邻接法分析计算本次试验以及从GenBank下载24种三代虫的ITS1-5.8S-ITS2序列，构建NJ树（见图4-6）。从进化树可知细鳞鲑三代虫与大西洋鲑三代虫、粘鲈三代虫G.cernuae、梭鲈三代虫G.lucii等聚为一枝，处于进化树顶端；细锚三代虫与波兰的为同种，与小林三代虫G.kobayashii、长尖三代虫G.longoacuminatus等在中部聚为一枝，同时与细鳞鲑三代虫和细锚三代虫位于Limnonephrotus亚属的一枝；普氏三代虫和秀丽三代虫与波兰的同类三代虫、鳜三代虫G.phoxini聚为一枝。37 额尔齐斯河鱼类三代虫分类、流行情况及系统发育研究注：深蓝色表示碱基全部相同、玫红表示70%的碱基相同、浅蓝表示50%的碱基相同图4-3四种三代虫的ITS1-5.8S-28SrDNA序列Fig.4-3TheITS1-5.8S-28SrDNAsequencesoffourGyrodactylus38 新疆农业大学硕士学位论文图4-4秀丽三代虫与普氏三代虫ITS1-5.8S-ITS2rDNA序列同源性比较结果Fig.4-4ThecompareresultsofG.elegansandG.prostateITS1-5.8S-ITS2rDNAsequence图4-5ITS1-5.8S-ITS2rDNA区域的遗传距离Fig.4-5ThedistanceofITS1-5.8S-ITS2rDNAgeneticregion39 额尔齐斯河鱼类三代虫分类、流行情况及系统发育研究100G.brachymystacisCanada65G.brachymystacisChina42G.salarisUKG.derjaviniUK7650G.luciiRussia100G.luciopercaePoland100G.cernuaePoland100G.parvaeCanadaLimnonephrotusG.GurleyiChinaG.LongoacuminatusChina9799G.kobayashiiChina62G.sprostonaePoland46100G.sprostonaeChina94G.eyipayipiNorway100G.robustusPolandMetanephrotusG.flesiPoland100G.branchicusPolandMesonephrotus64G.arcuatusPolandG.jennyaeBelgiumG.phoxiniPoland100G.prostateChina100G.elegansChina100GyrodactylusG.prostaePoland4536G.elegansPolandPseudodactylogyrusbiniDenmark0.05图4-6运用NJ法构建的ITS1-5.8S-ITS2rDNA序列进化树Fig.4-6ThephylogenetictreeofparasitesITS1-5.8S-ITS2rDNAsequencestructureusingNJmethod4.3讨论本次实验所有宿主均来源于额尔齐斯河，该河流域较广，发源于中国新疆阿尔泰山南麓，自东向西流经中国、哈萨克斯坦、俄罗斯最终汇入北冰洋，是一条跨国河流，物[96]种资源类型丰富。该河流域在鱼类区划中属于西伯利亚分区，同时又与北欧分区相邻，40 新疆农业大学硕士学位论文近年来，伴随着鱼类洄游和人工鱼苗的引入，额尔齐斯河流域与周边国家河流内鱼类的[95]种类有很大一部分相同，资料表明我国与俄罗斯有23种同种鱼类，这些鱼类与我国内陆水体分布鱼类大不相同。目前，关于额尔齐斯河这四种三代虫的研究相对较少，资[75]料显示赵江山曾报道了一新纪录种—普氏三代虫，吴宝华和贺怀亚对新疆发现的秀丽[1,39]三代虫和江鳕三代虫进行了描述。近些年，国内关于三代虫的研究多为形态学和疾病防控方面，分子方面较少，仅有李冉冉做了金鱼的秀丽三代虫及细锚三代虫的分子生[3]物学研究。因此本文首次对额尔齐斯河发现的这四种三代虫进行了形态学和分子研究。本实验结合形态学和分子生物学的方法，发现四种三代虫，分别是细锚三代虫、秀丽三代虫、普氏三代虫、细鳞鲑三代虫。形态学方面与国内外报道的这几种三代虫的中央大钩、边缘小钩、交配囊的形态测量数据基本一致，但寄生于东方欧鳊体表的秀丽三[1][103]代虫与《中国动物志》中央大钩绘图略有不同，而与俄文资料记载高度一致，主要是裙棒细长，两基部呈张开的V字形，明显有别于其它三代虫。有资料记载，秀丽三代[104]虫最早是发现于欧洲的欧鳊而命名的，并且一般不会感染欧鳊属以外的鱼类，同时[3]李冉冉在金鱼秀丽三代虫的研究中提到了秀丽三代虫对欧鳊属的特异性问题，这与本实验发现东方欧鳊感染的三代虫都是秀丽三代虫相符。[1,7]三代虫作为单殖吸虫的一个古老的生物类群，对生物进化等研究具有很大意义。然而三代虫虫体透明且小，种与种之间较为相似，仅依靠显微镜来鉴定难免会不准确。本文采用Cunningham等发展的以核糖体基因中的内转录间隔区（ITS-1和ITS-2）和5.8S[63]rDNA作为标记基因对三代虫分类进行研究，28SrDNA（V4可变区）虽然易于用通[7]用引物扩增，却因此存在一定的局限性，不能区分G.thymalli和G.teuchis；18SrDNA的V4可变区信息量足够但较短，相对不易扩增；所以对三代虫基因组而言，ITS-1和ITS-2比V4可变区更有效，即使是很相似的种也可以通过分子标记序列来鉴别。分子生物学实验结果显示，四种三代虫ITS1-5.8S-ITS2rDNA序列与GenBank比对相似率在99%以上，与波兰、丹麦等欧洲国家的更为相近，NJ进化树中细锚三代虫、细鳞鲑三代虫聚为一枝，属于Limnonephrotus亚属，该属的三代虫宿主大多来自欧洲区系的冷水鱼类，比如白斑狗鱼三代虫、梭鲈三代虫、粘鲈三代虫等，在我国内陆淡水鱼类中分布较少。细鳞鲑三代虫与大西洋鲑三代虫位于同一枝，遗传距离仅0.006，亲缘41 额尔齐斯河鱼类三代虫分类、流行情况及系统发育研究关系较近，这也许与宿主的亲缘关系的远近有关。同时秀丽三代虫和普氏三代虫位于进化树的最底端，均为Gyrodactylus亚属，位于同一枝，遗传距离较近，比对两虫种的ITS序列仅有两个碱基不同，以致序列相似率较高，仅从分子角度比对很难区分，也许会存在同名异种的情况，但两者形态明显不同，所以三代虫的鉴定有必要结合形态学分子生物学方法才更准确。并且在序列的选择方面，国内外最初研究的是28S，该序列高度保守易于扩增，后来到18S的V4可变区，虽然可以显示变化信息但有点短，5.8S高度保[38]守可用也很短，唯独ITS序列变异相对较大。所以为了更好的建立三代虫的系统发育体系，最终选择部分ITS1-5.8S-ITS2rDNA的序列，来进行种和亚属的区分，并且ITS-1[3]序列也可以更好的进行种间区分，本次实验结果也证明了该序列的有效性。根据以上分析，分布于额尔齐斯河（中国段）内的银鲫、东方欧鳊、虹鳟和金鳟、粘鲈体表感染的三代虫可依次确定为细锚三代虫、秀丽三代虫、细鳞鲑三代虫、普氏三代虫，基于ITS1-5.8S-ITS2分子分类结果支持这一观点。42 新疆农业大学硕士学位论文第5章结论本研究从2009年8月至2014年8月期间，对额尔齐斯河鱼类寄生三代虫种类及三代虫感染情况进行调查，并对其进行系统发育研究，主要结论如下：（1）本次采集鱼类标本计1638尾，有16种鱼均被三代虫感染。三代虫总感染率为5.27%，其中感染率最高为鲤鱼，最低的为河鲈；除东方欧鳊和鲤外，其余的感染率均不超过10%。（2）鉴定的三代虫种类共14种，分别是：细鳞鲑三代虫（G.brachymystacis）、白斑狗鱼三代虫（G.lucii）、丁鱥三代虫（G.tinca）、马氏三代虫（G.markakulensis）、梭鲈三代虫（G.luciopercae）、秀丽三代虫（G.elegans）、普氏三代虫（G.prostate）、鮈三代虫（G.gobionum）、中型三代虫（G.medium）、鲤三代虫（G.cyprini）、细锚三代虫（G.sprostonae）、江鳕三代虫（G.lotae）、三代虫未定种1、三代虫未定种2。（3）白斑狗鱼三代虫、丁鱥三代虫、马氏三代虫、梭鲈三代虫与俄罗斯报道的为同种，在我国至今未见报道，由此确定为我国三代虫新纪录种。（4）鲤、东方欧鳊、银鲫比较容易感染三代虫，感染率和感染强度相对较高，呈聚集分布；丁鱥、粘鲈、河鲈、白斑狗鱼、江鳕均感染较少，呈均匀分布。（5）不同宿主感染三代虫的种类数量不同，大多数宿主只感染1种三代虫，也存在同时感染2～4种，也有1种三代虫寄生多种宿主的现象。（6）测定细锚三代虫、秀丽三代虫、细鳞鲑三代虫、普氏三代虫虫体ITS1-5.8S-ITS2rDNA基因序列，获得四个登录号（KP295469、KP325623、KP295468、KP325622）。细鳞鲑三代虫和细锚三代虫位于Limnonephrotus亚属的一枝，秀丽三代虫和普氏三代虫位于Gyrodactylus亚属的一枝，两亚属亲缘关系较远。43 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额尔齐斯河鱼类三代虫分类、流行情况及系统发育研究附录Ⅰ常用试剂的配制一、寄生虫采集及标本制作所用试剂1．75%酒精配制量：100mL无水乙醇75mL蒸馏水25mL2．4%聚乙烯醇乳酸酚混合液配制量：100mL首先称4g聚乙烯醇粉末，加入100mL酚（石炭酸）和乳酸的等量混合液（50mL酚加50mL乳酸）。水浴约3～4h，待聚乙烯醇完全溶解，然后加入少量的酸性品红，最终颜色呈玫瑰红色。3．苦味酸铵染色液配置量：配制量：100mL在水温60℃，搅拌器转速300rpm，配置苦味酸铵（2，4，6-三硝基苯酚胺）100mL饱和溶液（有晶体析出就饱和了），过滤。将滤液在通风处加入氨水，待晶体析出过滤。将滤液和甘油1:1混合保存即可。4．1%盐酸酒精配制量：100mL70%酒精99mL盐酸1mL5．乳酚透明液乳酸10mL石炭酸10mL甘油20mL蒸馏水10mL6．甘油明胶50 新疆农业大学硕士学位论文甘油100mL明胶20g石炭酸2.5g蒸馏水125mL二、三代虫分子生物学研究所用试剂7．1mol/LTris-HCl（pH8.0）配制量：1000mL首先称取121.1gTris碱，加入800mL双蒸水中，然后加入浓盐酸调pH至8.0，再加入浓HCl46mL，加入双蒸水定容至1000mL，最后高压灭菌（121℃15min），4℃保存。8．0.5mol/LEDTA（pH8.0）配置量：1000mL首先称186.1gNa2EDTA·2H2O，20gNaOH，加入800mL双蒸水中溶解，定容至1L，高压灭菌（121℃15min），4℃保存备用。9．TE缓冲液（pH8.0）成分及终浓度配置100mL溶液各成份的用量10mmol/LTris-HCl1mL1mol/LTris-HCl（pH8.0）1mmol/LEDTA200μL0.5mol/LEDTA（pH8.0）水98.8mL10．2%琼脂糖凝胶配制量：50mL首先称取琼脂糖凝胶1.0g，然后加入50mL1×Tris-乙酸（TAE）缓冲液于锥形瓶中，在微波率中分三次加热，每次1min溶解。11．LB液体培养基配制量：100mL首先称取胰蛋白胨1g，酵母浸粉0.5g，NaCl1g于烧杯中，加入双蒸水约80mL，搅拌溶解；然后加入NaOH调节pH值至7.0，最后加双蒸水定容至100mL。装入锥形51 额尔齐斯河鱼类三代虫分类、流行情况及系统发育研究瓶中，高压灭菌（121℃15min），4℃保存备用。12．LB固体培养基100mLLB液体培养基，1.5g琼脂粉，搅拌混匀后高温高压灭菌，4℃保存备用。13．100mg/mLAmp配置量：10mL称取1gAmp溶解于10mL去离子水中，用滤菌器过滤除菌，然后封装成小份备用。14．AmpLB液体培养基配制量：100mL100mLLB液体培养基，高压后冷却至55℃，加入Amp贮存液，最终浓度为100μg/mL。15．AmpLB固体培养基配制量：100mL将琼脂粉1.5g溶于100mL液体培养基，高压灭菌（121℃20min）后冷却至55℃，加入Amp至终浓度为100μg/mL，倒平板，静置凝固4℃保存。16．100mmol/LCaCl2配制量：100mL称取1.110gCaCl2于100mL容量瓶中，加入约80mL的双蒸水，充分搅拌溶解，用HCl调pH值为5.5，然后加水定容至100mL，搅拌溶解121℃高温高压灭菌，4℃保存。17．电泳缓冲液50×Tris-乙酸（TAE）缓冲液（水补足至1L）成份及终浓度配制1L溶液各成分的用量2mol/LTris碱242gTris碱1mol/L乙酸57.1mL的冰乙酸（17.4mol/L）100mmol/LEDTA200mL0.5mol/LEDTA（pH8.0）52 新疆农业大学硕士学位论文附录Ⅱ部分实验鱼和寄生虫标本图Ⅱ-1东方欧鳊（Abramisbramaorientalis）图Ⅱ-2丁鱥（TincatincaLinnaeus）图II-3粘鲈（AcerinacernuaLinnaeus）图Ⅱ-4江鳕（LotalotaLinnaeus）图Ⅱ-5白斑狗鱼（Esoxlucius）图Ⅱ-6梭鲈（Luciopercalucioperca）图Ⅱ-7棒花鱼（Abbottinarivularis）图Ⅱ-8尖鳍鮈（Gobiogobio）53 额尔齐斯河鱼类三代虫分类、流行情况及系统发育研究图Ⅱ-9虹鳟体表（Oncorhynchusmykiss）图Ⅱ-10粘鲈体表乳酸酚染色苦味酸铵染色细鳞鲑三代虫（G.brachymystacis）梭鲈三代虫（G.luciopercae）图Ⅱ-11电镜全三代虫图图Ⅱ-12电镜边缘小钩图Ⅱ-13电镜棒裙、腹联结片图Ⅱ-14电镜中央大钩54 新疆农业大学硕士学位论文部分三代虫几丁质鉴定结构图ecadfbg0.020.0050.005ABC图Ⅱ-15细锚三代虫G.sprostonae图Ⅱ-16秀丽三代虫G.elegans图Ⅱ-17普氏三代虫G.prostate图Ⅱ-18细鳞鲑三代虫G.brachymystacisA.中央大钩（Anchor）B.边缘小钩（Marginalhook）C.交配囊（Cirruspouch）a背联结片；b副联结片；c钩体；d钩柄；e扣环；f交配囊大刺；g小刺55 额尔齐斯河鱼类三代虫分类、流行情况及系统发育研究外出采样实验情景56 新疆农业大学硕士学位论文致谢在论文完成之际，我想感谢给予帮助的每一个人。首先感谢我的导师岳城教授，在研究生这三年期间对学习给予的指导和生活的关心帮助。感谢恩师的谆谆教导，恩师高尚的人格、渊博的学识、正直的品质、严谨的治学作风、乐观的生活态度以及无私奉献的精神深深影响着您的每一个弟子,将会使我受益终身!感谢中科院水生所姚卫建老师在虫种鉴定方面给予的帮助和指导，以及李冉冉学姐在三代虫实验方法及参考文献方面给予的帮助，在此表示由衷的感谢!在论文的完成过程中,得到了新疆水产养殖者的大力支持和帮助，在此表示诚挚的谢意!感谢我的同门师兄妹焦丽、郝翠兰、秦丽、王新、温卫栋、王京京等同学的大力帮助，感谢番林、党瑞、杨海龙、周花燕等同学在生活和实验工作中的帮助，谢谢您们!感谢我的同窗王美玲、张彩云、张玉婷等同学在学习、生活中的帮助与关怀，一同度过的时光让我难忘!感谢我的父母为我提供及不断支持继续求学这样珍惜而难得的机会，同时也感谢我的家人和朋友,您们的关怀、支持与鼓励陪伴着我的成长,是我前进的动力。最后感谢每一位给予我关心和帮助的人!57 额尔齐斯河鱼类三代虫分类、流行情况及系统发育研究作者简介姓名：张薇性别：女民族：汉族出生年月：1989年4月籍贯：新疆昌吉教育经历：2008年9月至20112年7月就读于新疆农业大学动物医学学院临床专业；2012年9月至2015年7月就读于新疆农业大学动物医学学院预防兽医学专业。攻读硕士学位期间参加课题情况：1、国家自然科学基金项目《额尔齐斯河鱼类寄生虫区系研究》(NO：30860216)2、国家自然科学基金《额尔齐斯河鱼类单殖吸虫种群生态学及系统发育研究》(NO.31160535)3、科技支疆项目《新疆主要土著经济鱼类病害防治关键技术开发》(NO:201191136)4、淡水生态与生物技术国家重点实验室开放课题《额尔齐斯河鱼类单殖吸虫种群生态学及系统发育研究》(NO：2010FB06)参加会议及获奖情况：1、2014年10月在新疆大学参加“自治区动物学会年会”，并做了《额尔齐斯河三代虫种类及调查研究》报告。2、并获得“新疆青年科学家论坛”优秀论文三等奖。3、2014年11月在湖南长沙参加“中国水产学会”，代表课题组在大会上作有关三代虫种类的报告。发表论文情况：1、张薇,郝翠兰,王新,岳城.额尔齐斯河三代虫种类研究及新纪录种的记述[J].水生态杂志,2015,36(2):68-74.2、张薇,王真,王新,邵俊高,巴音查汗.牦牛体表寄生硬蜱的鉴定及吸血前后观察[J].新疆畜牧业,2012,08:28-30.3、秦莉,殷建国,张薇,贾舒安,岳城.白斑狗鱼(Esoxlucius)致病性嗜水气单胞菌的分离与鉴定[J].渔业科学进展,2014,05:40-45.4、张薇,焦丽,郝翠兰,王新,岳城.额尔齐斯河三代虫种类及流行病学调查.中国水产学术年会论文摘要集.2014,10.58