采用新一代测序技术分析不同感染阶段乙型肝炎病毒准种异质性及其临床意义

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1、博士学位论文采用新一代测序技术分析不同感染阶段乙型肝炎病毒准种异质性及其临床意义作者姓名：杨之涛学号：0127209073申请学位：医学博士指导教师：张欣欣教授学科专业：内科学（感染病学）研究方向：病毒性肝炎的诊治及发病机制研究资助基金：“十二五”科技重大专项（2012ZX10002007）国家自然科学基金（81171616）培养单位：上海交通大学医学院附属瑞金医院培养时间：2012年9月-2015年8月答辩日期：2015年5月ShanghaiJiaoTongUniversityDoctoralDissertationCh

2、aracterizationofHBVgenomeHeterogeneityindifferentphasesofinfectionbyNextGenerationSequencinganditsclinicalimplicationsPh.D.Candidate:Zhi-TaoYangStudentID:0127209073Major:InternalMedicine(InfectiousDiseases)ResearchField:PathogenesisofViralHepatitisCollege:RuijinHo

3、spital,ShanghaiJiaoTongUniversity,SchoolofMedicineSupervisor:Prof.Xin-XinZhangM.D.&Ph.D.Financialsupport:TheMajorNationalS&TProjectsforInfectiousDiseases(2012ZX10002007)NationalNaturalScienceFoundationofChina(81171616)Studyperiod:2012.9~2015.8Vivavoceon2015.5上海交通大

4、学学位论文原创性声明，本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行祝巧工作所取得的成果。除文中己经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均己■在文中ｙＡ明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。為、学位论文作者签名；私备＇２０１５年４月１８日日期：＊上海交通大学学位论文版捉使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部口

5、或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权上海交通大学可＾将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，１＾可＾采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。（＾□。，在年解密后适用本授权书保密＿本学位论文属于不備Ｖ。＂＂（请在臥上方框内打Ｖ）＂指导教师签名：学位论文作者签名；冰ｒ扣巧＼和如辟嘴＇：拍曰期；心辟作化日曰期上海交通大学2012级博士学位论文中文摘要背景与目的本课题组之前采用克隆测序（CBS）的方法研究发现乙型肝炎病毒（HBV）逆转录酶区

6、（RT区）准种异质性可作为接受核苷类似物治疗患者抗病毒疗效的一个预测指标。近年来，第二代测序技术（NGS）以其相对快速、超深度、高灵敏度的特点给HBV准种研究带来了新的策略。目前对于HBV感染后不同临床阶段的病毒全长准种异质性的研究还未见报道。本研究应用CBS及NGS方法扩增并获得急性乙型肝炎（AHB）、慢性HBV携带（IT）、慢性乙型肝炎（CHB）、慢加急性乙型肝炎伴肝衰竭（ACLF）、代偿期肝硬化（LC）患者血清病毒全长序列，结合生物信息学分析方法描述准种遗传异质性特征及探讨其临床意义，以期更好的阐述HBV自然史及致病

7、机制。研究对象与方法本研究共纳入97名HBV感染的患者（AHB、IT、CHB、ACLF、LC）。40例应用CBS方法、87例应用NGS方法（30例同时应用两种方法）获得HBV全长基因组的准种后，通过生物信息学方法对准种的异质性（复杂度和离散度）特征进行分析，并建立了NGS大数据初筛流程和质控方法，最后分析五种不同感染阶段的病毒准种异质性、氨基酸突变指数、单个核苷酸复杂度、CP/PreC核苷酸突变率的特点及其与临床病程演变的相关性。结果第一部分：40例HBV感染患者，采用CBS方法，平均每名患者获得14-17株HBV全长克隆

8、，急性HBV感染的准种复杂度较慢性HBV感染的准种复杂度低；慢性HBV感染免疫耐受期准种复杂度低于免疫清除期；不同的免疫压力下Core区aa60-130及X区aa131-135氨基酸变异指数（MFI）有统计学差异，ACLF在这些区域氨基酸突变指数大于IT及AHB，CHB次之。高突变位点集中在Core区T