分子实验—--影响pcr扩增因素分析

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1、...页眉影响PCR扩增因素的分析【摘要】聚合酶链反应(PCR)技术问世以来，已经在生物学研究领域内得到了巨大的发展并不断完善，不仅广泛应用在基础研究领域，在疾病诊断等方面也有了越来越广泛深入的研究和应用。该反应具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点,经过不断改良，PCR技术已成为分子生物学研究常用的手段。通过阅读大量文献资料，本文对聚合酶链式反应(PCR)的基本概念、工作原理以及影响其扩增的因素各方面作了概述。【关键词】聚合酶链式反应(PCR)温度引物TaqDNA聚合酶前言:DNA的半保留复制是

2、生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。实验发现，DNA在高温时发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。聚合酶链式反应（英文全称：PolymeraseChainReaction），简称PCR，又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。是体外酶促合成特异DN

3、A片段的一种方法，其最基本的3个环节是:①DNA变性：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA。②退火（复性）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。③延伸：在Taq酶（在72℃左右最佳的活性）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的DNA链。由以上三个环节组成一个周期，循环进行，每一循环，DNA含量增加一倍，此方法操作简便快速，并且非常有效，可在很短的时间内得到数百万个特异DNA序列的拷贝。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用

4、于疾病的诊断或任何有DNA，RNA的地方。目前为止，PCR技术已有十几种之多，如将PCR与反转录酶结合，成为反转录PCR，将PCR与抗体等相结合就成为免疫PCR等。1.引物....页脚...页眉要扩增模板DNA，首先要设计两条寡核苷酸引物，所谓引物，实际上就是两段与待扩增靶DNA序列互补的寡核苷酸片段，两引物间距离决定扩增片段的长度，两引物的5’端决定扩增产物的两个5’末端位置。由此可见，引物是决定PCR扩增片段长度、位置和结果的关键，引物设计也就更为重要。设计引物应遵循以下原则：①引物长度根据统计学计

5、算，长约17个碱基的寡核苷酸序列在人的基因组中可能出现的机率的为1次。因此，引物长度一般最低不少于16个核苷酸，而最高不超过30个核苷酸，最佳长度为20～24个核苷酸。这样短的寡核苷酸在聚合反应温度（通过72℃）下不会形成稳定的杂合体。有时可在5’端添加不与模板互补的序列，如限制性酶切位点或启动因子等，以完成基因克隆和其他特殊需要；引物5’端生物素标记或荧光标记可用于微生物检测等各种目的。②引物扩增跨度以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。③引物碱基引物的组成应均匀，尽量避免含有

6、相同的碱基多聚体。两个引物中（G+C）%含量应尽量相似，在已知扩增片段（G+C）%含量时宜接近于待扩增片段，一般以40%～60%为佳，+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。④避免引物内部出现二级结构，引物之间两个引物之间不应发生互补。特别是在引物3’端，即使无法避免，其3’端互补碱基也不应大于2个碱基，否则易生成“引物二聚体”或“引物二倍体”（Primerdimer）。所谓引物二聚体实质上是在DNA聚合酶作用下，一条引物在另一条

7、引物序列上进行延伸所形成的与二条引物长度相近的双链DNA片段，是PCR常见的副产品，有时甚至成为主要产物。⑤引物3’端配对DNA聚合酶是在引物3’端添加单核苷酸，所以引物3’端5～6个碱基与靶DNA的配对要求必须精确和严格，这样才能保证PCR有效扩增。⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。⑦引物的特异性....页脚...页眉两条引物之间避免有同源序列，尤为连续6个以上相同碱基的寡核苷酸片段，否则两条引物会相互竞争模板的同一位点；同样，引物与

8、待扩增靶DNA或样品DNA的其它序列也不能存在6个以上碱基的同源序列。否则，引物就会与其它位点结合，使特异扩增减少，非特异扩增增加。2.酶及其浓度早在1956年Kornberg等就从大肠杆菌提取液中发现了DNA聚合酶，并且得到了DNA聚合酶Ⅰ纯品。DNA聚合酶Ⅰ是由分子量为109000的一条多肽链构成，此酶可被枯草杆菌蛋白酶分解为两个片段，一个片段分子量为76000，有聚合酶活性，并有3’→5外切酶活力，即Klenow片段（Klenowfr