眼斑芫菁法呢基焦磷酸合酶fpps基因的克隆及功能研究

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1、眼斑芫菁法呢基焦磷酸合酶FPPS基因的克隆及功能研究重庆大学硕士学位论文（学术学位）学生姓名：查神芳指导教师：殷幼平教授专业：药学学科门类：理学重庆大学生命科学学院二O一五年四月ThegenecloningandfunctionalstudyoffarnesyldiphosphatesynthaseinMylabriscichoriiAThesisSubmittedtoChongqingUniversityinPartialFulfillmentoftheRequirementfortheMaster’sDegreeof

2、ScienceByShenfangZhaSupervisedbyProf.YoupingYinSpecialty:PharmacySchoolofLifeScience，ChongqingUniversity,Chongqing,ChinaApril,2015中文摘要摘要眼斑芫菁民间俗称黄黑小斑蝥（MylabriscichoriiLinnaeus），为昆虫纲鞘翅目（Coleoptera）芫菁科（Meloidae）斑芫菁属（Mylabris）昆虫。它是我国历史上的传统中药材之一，同时也是我国药典收录的重要动物药之一。斑蝥素

3、（Cantharidin），一种倍半萜类的天然防御物质。这种毒素物质在昆虫体内合成的途径是一个尚未解决的科学问题。近年来由于其在临床医学上具有显著的抗肿瘤、抗癌等作用，所以人们对斑蝥素的需求急剧增加，但是芫菁科昆虫的人工饲养难题尚未解决，而且斑蝥素的化学合成条件苛刻，因此研究斑蝥素的生物合成途径可能为解决斑蝥素来源问题提供一些新的思路。斑蝥素生物合成的研究已经经历了数十年，并且也取得了一些突破性的成果，但是到目前为止仍没有完全弄清楚斑蝥素生物合成的具体途径。并且关于斑蝥素生物合成途径中的基因分子水平、酶水平研究也很少，所

4、以对斑蝥素生物合成途径的相关基因、酶进行研究将为弄清楚斑蝥素的生物合成途径奠定基础。本文对倍半萜类物质代谢途径中的关键酶——法呢基焦磷酸合酶（FPPS）在眼斑芫菁斑蝥素生物合成途径中的功能进行了研究，主要研究结果如下：1.McFPPS基因cDNA全长的克隆及序列分析采用SMARTRACE等技术，克隆获得了该基因的cDNA全长序列，并将其命名为McFPPS，其Genbank登录号为KM514312。该基因cDNA全长为1507bp。使用在线软件ORFfinder及ExPASy等对该基因进行生物信息学分析，发现：其开放阅读框

5、为1278bp，共编码425个氨基酸，其理论蛋白分子量为49.452KDa，理论等电点为8.91；McFPPS蛋白有跨膜结构，亚细胞定位预测其定位于线粒体膜上，不具有信号肽。通过多序列同源比对发现：McFPPS蛋白包含所有FPPS蛋白的七个保守区域I-VII，其中包括两个典型的富含天冬氨酸的保守结构域DDXXD。另外，通过MEGA4软件构建进化树对该蛋白的进化关系进行分析，发现：所有昆虫单独聚为一支，其中眼斑芫菁与其他鞘翅目昆虫又单独聚为一支，并与豆芫菁（Epicautagorhami）的关系最近。2.McFPPS基因及

6、其下游基因STE24（命名为McSTE24）的时期表达谱分析采用实时定量PCR（RT-qPCR）技术对McFPPS基因在雌、雄成虫六个时期（5d，10d，15d，20d，25d，30d）的表达谱进行分析。分析结果表明McFPPS基因在雌、雄虫的各个时期均有表达。雄虫中，5-20d基因表达量逐渐升高，20d出现峰值，而25d-30d其表达量又逐渐下降，这与McSTE24在雄虫中的表达模式一致。雌虫中，该基因的表达量在前15d均变化不大，但在20d-25d时该基因的I重庆大学硕士学位论文表达量急剧下降，而在30d时，其表达量

7、又上升。以上的结果与眼斑芫菁中斑蝥素含量基本一致。3.McFPPS基因的组织表达谱分析通过采用RT-qPCR对McFPPS基因在雄虫（20d）腹部五个组织（精巢、附腺、前肠、中肠、后肠）的表达谱进行分析，该分析结果显示McFPPS基因在各组织中均有表达，其中在肠道的表达量均较高，尤其后肠中的表达量最高。4.McFPPS基因的干扰体外合成McFPPS基因的双链RNA（dsRNA），并以注射的方式对17-18d的雄虫及5龄幼虫McFPPS基因进行干扰，进一步研究该基因的功能。研究结果发现：不管在雄成虫还是幼虫中该基因的24h

8、干扰效率均比48h（与对照组比较）高，故对干扰24h样品中的下游基因表达量和下游产物含量进行检测。检测结果表明不管在雄成虫还是幼虫中，当干扰McFPPS基因后，下游基因的表达量和斑蝥素的含量均有明显的降低。5.McFPPS基因的原核表达通过构建原核表达载体pET30a-McFPPS，成功获得了该基因的表达蛋白，并且进