棉花枯萎病菌拮抗菌的筛选和抑菌机理初探

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1、TheResearchesonscreeningandmechanismofantagonisticbacteriainCottonFusariumwiltADissertationSubmittedtoShiheziUniversityInPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofNaturalScienceByCuiZheng-long(Microbiology)DissertationSupervisor:AssociateProfessorWangAi-yin

2、gJune,2015摘要目的：本研究从乌拉尔甘草、阿魏和苦豆子中筛选出拮抗棉花枯萎病菌的内生菌，初步分离拮抗菌A的抑菌物质，探究抑菌机理，并研究拮抗菌对棉花生长的影响。方法：拮抗菌的分离和筛选采用平板培养法，生长曲线、最适pH、糖发酵、淀粉水解试验及革兰氏染色对拮抗菌的基本性质进行了研究；通过16SrDNA序列比对建立系统进化树。超声波破碎细胞，离心分离胞内、胞外分泌物，硫酸铵沉淀透析法分离胞内抑菌粗蛋白，考马斯亮蓝G-250法检测蛋白浓度，SephadexG-75柱层析初步纯化抑菌蛋白，SDS-PAGE法测定抑菌蛋白分子量大小。抑菌物质

3、对棉花枯萎病菌菌丝生长、产分生孢子和分生孢子萌发的影响分别采用平板培养法、显微计数法、凹玻片培养法。检测了拮抗菌A处理棉花种子后，其萌发率和成株率的变化，以及棉苗在不同生长时期的POD、PPO、PAL活性。结果：1、本研究从乌拉尔甘草、阿魏和苦豆子中分离并筛选得到了4株对棉花枯萎病菌具有拮抗性的内生菌，其中拮抗菌A抑菌效果最好，初筛抑菌圈直径达26.96mm。经过鉴定，拮抗菌A、B、C、D分别属于Bacillusamyloliquefaciens、Bacillustequilensis、Bacillussp.、Klebsiellapneu

4、moniae。2、拮抗菌A的胞内分泌物对棉花枯萎病菌菌丝生长、产分生孢子和分生分生孢子萌发的抑制率均大于胞外分泌物。其中对棉花枯萎病菌产分生孢子的抑制效果最好，平均抑制率为40.14%，对数生长期的拮抗菌对产分生孢子的抑制率最大，为88.81%。3、浓度为80%的硫酸铵沉淀出的蛋白对棉花枯萎病菌的抑制率最大(19.55%)。分离的粗蛋白保持抑菌活性的最高耐受温度为60℃，最高耐受pH为8，最低耐受pH为4。4、抑菌粗蛋白经过SephadexG-75柱层析分离，在200-400s之间收集的洗脱液对棉花枯萎病菌产分生孢子的抑制率达34.79%

5、，均大于其对菌丝生长和分生孢子萌发的抑制率。初步分离得到的抑菌蛋白分子量在25kDa-100kDa之间。5、拮抗菌A处理棉花种子后可提高其成株率。棉花苗期不同生长时期的POD、PPO、PAL酶活性测定结果表明，接种棉花枯萎病菌后，用拮抗菌A处理过的棉花植株在播种40d后PAL酶活性显著增加；此外，同一生长时期、不同处理的棉苗3种酶活性均无显著差异。结论：本研究从乌拉尔甘草、阿魏和苦豆子中分离并筛选得到了4株对棉花枯萎病菌抑制作用较好的内生菌，初步探究了拮抗菌A的抑菌机理；拮抗菌A抑菌物质产生于对数生长期，胞内分泌物抑菌效果较好，主要抑制途

6、径为抑制棉花枯萎病菌产分生孢子；抑菌粗蛋白对温度和pH的稳定性均可以满足生产实践的需要；初步纯化的抑菌蛋白的分子量在25kDa-100kDa之间，且仍保持一定的抑菌活性；拮抗菌A处理棉花种子后可提高其成株率，但棉花幼苗的活性氧酶系统无明显增强。关键词：棉花枯萎病，拮抗菌，胞内分泌物，胞外分泌物，抑菌蛋白IAbstractObjective:ThisstudyisolatedandscreenedendophyticbacteriainhibitedonFusariumWiltofcottons(Fusariumoxysporium)fro

7、mGlycyrrhizauralensis,SophoraalopecuroidesandResinaFerulae.SeparatedtheantibacterialsubstanceofantagonisticbacteriaApreliminarily,exploredtheantibacterialmechanism,andobserveditseffectoncottons.Methods:Theisolationandscreeningofantagonisticbacteriabyplateculturemethod.The

8、basicpropertiesofantagonisticbacteriaincludinggrowthcurve,theoptimumpH,sugarfermentation,starchh