辣椒疫病生防菌的筛选、鉴定及其抑菌机理初探

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1、辣椒疫病生防菌的筛选、鉴定及其抑菌机理初探吴辉，潘梦武，高易宏，李建文，姚少林，孙文秀（长江大学生命科学学院，湖北荆州４３４０２５）摘要：采用平板稀释法和平板对峙试验，从武汉、荆州、宜昌和荆门等地的辣椒根际土壤中分离到１８５株细菌，筛选到１株具有高效拮抗辣椒疫霉菌（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａｃａｐｓｉｃｉ）的生防菌Ｂｓ０４。通过形态学观察、生理生化指标测定、１６ＳｒＤＮＡ序列测定及进化树构建，确定菌株Ｂｓ０４为枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）。Ｂｓ０４对辣椒疫霉菌丝生长抑制率达８０％，同时对烟草黑胫病菌（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａｐａｒａｓｉｔｉｃａｖａｒ．ｎｉｃｏｔ

2、ｉａｎａ）、棉花黄萎病菌（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍｄａｈｌｉａｅ）、棉花枯萎病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍf.sb．ｖｅｓｉｎｆｅｃｔｕｍ）和黄瓜立枯病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａｎｉ）具有明显的抑制作用。利用光学显微镜观察Ｂｓ０４对辣椒疫霉菌丝形态的影响，发现菌丝分支增多、顶端畸形、原生质浓缩及生长缓慢等现象，表明Ｂｓ０４具有显著的抑菌作用。..关键词：辣椒疫霉菌（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａｃａｐｓｉｃｉ）；生防菌；鉴定；抑菌机理中图分类号：Ｓ４３６文献标识码：A：0439－８114（２０15）07－1596-04DOI:10.14088/j.ki.issn043

3、9-8114.2015.07.016辣椒疫病由辣椒疫霉菌（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａｃａｐｓｉｃｉ）引起，是重要的辣椒根茎病害之一，在中国及世界其他国家辣椒生产区发生严重，给辣椒生产造成巨大的经济损失。对于辣椒疫病的防治大多采用化学防治，而大量使用化学药剂导致了环境的严重污染，对消费者的身体健康产生了不利影响。目前，由于辣椒抗疫病品种较少，且多为中抗或不耐病品种，难以有效地控制辣椒疫病。因此，寻找安全有效的防治措施成为控制辣椒疫病的一个亟待解决的问题。植物病害的生物防治是利用有益生物和生物代谢产物对植物病害进行有效防治的技术与方法，具有无毒、无害、无污染和高效等优点，受到了研究者的

4、青睐。关于辣椒疫病的生物防治国内外均有相关研究报道［１－４］，但主要集中在生防菌的防效和应用上，对其控病机理研究却较少。在此基础上，针对湖北省辣椒疫病发生严重的状况，本研究从辣椒根际土壤中分离生防菌株，并对其进行鉴定，初步探讨生防菌的抑菌机理，为有效地防治辣椒疫病奠定基础。１材料与方法１．１供试菌株和培养基辣椒疫病菌（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａｃａｐｓｉｃｉ）、烟草黑胫病菌（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａｐａｒａｓｉｔｉｃａｖａｒ．ｎｉｃｏｔｉａｎａ）、棉花黄萎病菌（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍｄａｈｌｉａｅ）、棉花枯萎病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍf.sb．ｖｅｓｉｎｆｅｃｔｕｍ

5、）、黄瓜立枯病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａｎｉ）均由长江大学生命科学院实验室保存。培养基为牛肉膏蛋白胨培养基（ＮＡ）、马铃薯葡萄糖培养基（ＰＤＡ）。１．２土样采集和处理从武汉、荆州、宜昌和荆门等辣椒种植区疫病发生严重的田地，利用五点采样法从生长健康辣椒根际采集土样。采样时铲去表层５ｃｍ土层，取新鲜土样５００ｇ，用保鲜袋保存。称取土样１０ｇ加入装有９０ｍＬ无菌水的三角瓶中（内装玻璃珠若干），３０℃、１２０ｒ／ｍｉｎ振荡３０ｍｉｎ，静置后获得土壤悬液。１．３生防细菌的筛选将土壤悬液稀释成１０－５、１０－６、１０－７浓度，吸取不同稀释度的土壤悬液１００μＬ涂布于ＮＡ培养基上，置于

6、２８℃培养４８ｈ，挑取颜色、形态等不同的细菌单菌落并纯化、保存。采用平板对峙法测定分离到的细菌对辣椒疫霉的抑菌活性。将辣椒疫霉菌在ＰＤＡ平板上活化，用打孔器在菌落边缘打取菌块（直径６ｍｍ），接种到ＰＤＡ平板中央。培养１ｄ后，在距离辣椒疫霉菌块２ｃｍ处的４个对接点接种待测细菌，２８℃培养，５ｄ后观察抑菌结果，每个处理设３次重复。１．４拮抗菌株的鉴定将筛选到的抑菌效果较好的菌株进行菌落形态观察、显微形态观察、革兰氏染色、芽孢染色、水解淀粉试验、甲基红试验（Ｍ．Ｒ）、Ｖ．Ｐ试验、柠檬酸盐试验、接触酶反应试验、明胶液化试验、运动性试验等主要形态和生理生化指标鉴定［５，６］。参照文献［７］

7、方法提取疑似枯草芽孢杆菌基因组ＤＮＡ。根据已报道的枯草芽孢杆菌１６ＳｒＤＮＡ的保守区序列设计引物ＢｓＦ（５′－ＴＧＣＡＣＡＣＡＣＣＧＣＣＣＧＴ－３′）和ＢｓＲ（５′－ＧＧＧＴＴＧＣＣＣＣＡＴＴＣＧ－３′），以枯草芽孢杆菌疑似株基因组为模板，进行ＰＣＲ扩增。ＰＣＲ反应程序为：９４℃预变性４ｍｉｎ；９４℃变性１ｍｉｎ，５４℃退火３０ｓ，７２℃延伸１ｍｉｎ，共３０个循环；最后７２℃延伸１０ｍｉｎ。ＰＣＲ产物经试剂盒纯化后测序，将测序结果与ＧｅｎＢａｎｋ数据库中的序列进行对比分析，利用Ｍ