棉铃虫serpin基因的克隆、表达及feeding rnai分析

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1、密级：学校代码：10075分类号：学号：20121220理学硕士学位论文棉铃虫Serpin基因的克隆、表达及FeedingRNAi分析学位申请人：孙姣姣指导教师：李继刚教授学位类别：理学硕士学科专业：植物学授予单位：河北大学答辩日期：二〇一五年六月ClassifiedIndex:CODE:10075U.D.C.:NO:20121220ADissertationfortheDegreeofM.ScienceCloning,ExpressionandFeedingRNAiAnalysisofSerpinGenefromCottonBollwormCandidat

2、e:SunJiaojiaoSupervisor:ProfessorLiJigangAcademicDegreeAppliedfor:MasterofScienceSpecialty:BotanyUniversity:HebeiUniversityDateofOralExamination:June,2015河北大学学位论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得河北大学或其他教育机构的学位或证书所使用过的

3、材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了致谢。作者签名：从、淡沾日期年一^月一^__日学位论文使用授权声明本人完全了解河北大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本学位论文属于1、保密口，在年月日解密后适用本授权声明。2、不保密“。(请在以上相应方格内打“V”)保护知识产权声明本人为申请河北大学学位所提交的题目为制_分辦的学位论文，是我个人在导师指导并与导师合作下取

4、得的研究成果，研究工作及取得的研究成果是在河北大学所提供的研究经费及导师的研宄经费资助下完成的。本人完全了解并严格遵守中华人民共和国为保护知识产权所制定的各项法律、行政法规以及河北大学的相关规定。本人声明如下：本论文的成果归河北大学所有，未经征得指导教师和河北大学的书面同意和授权，本人保证不以任何形式公开和传播科研成果和科研工作内容。如果违反本声明，本人愿意承担相应法律责任。声明人：仏⑷kk日期：年^•月4曰作者签名：M�妨妨眺」^年月¥日导丨而鮮：本务

5、日期：DrJT年月」^曰摘要摘要丝氨酸蛋白酶抑制剂是一类最大的、分布最为广泛的蛋白酶抑制剂超家族，它通过

6、抑制丝氨酸蛋白酶活性来集中控制许多重要的蛋白水解级联反应，影响蛋白质的代谢，在生物体中执行多种生物学功能。在昆虫中，丝氨酸蛋白酶抑制剂主要通过调节黑化反应和Toll路径来参与先天免疫反应。在植物中，丝氨酸蛋白酶抑制剂能够阻碍昆虫的生长和发育，是抵制害虫和病原体侵染的重要防御蛋白，因其抗虫谱广和作用机制独特，成为一种新型抗虫蛋白，也成为了植物抗虫基因工程中研究和应用越来越广泛的靶标蛋白。获得棉铃虫丝氨酸蛋白酶抑制剂基因是探究其结构、功能及作用机制的基础。本研究从棉铃虫中克隆出几个全新的丝氨酸蛋白酶抑制剂基因，利用生物信息学技术、实时定量PCR技术和RNA干涉技

7、术对该基因的基本特征、在棉铃虫中的分布及功能进行了初步探究，研究成果如下：（1）通过与已报道的家蚕serpin基因同源比对，利用RT-PCR技术成功克隆到三条与家蚕serpin相似性高的棉铃虫丝氨酸蛋白酶抑制剂基因分别命名为：Haspi-5、Haspi-6和Haspi-10。利用生物信息学技术对Haspi-5、Haspi-6和Haspi-10基因cDNA及其编码氨基酸序列进行了分析，构建了棉铃虫与其它昆虫serpin氨基酸序列的分子系统进化树。（2）利用基因重组技术成功构建了原核表达载体pET17b-Haspi-5、pET17b-Haspi-6和pET17b

8、-Haspi-10，转入大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21(DE3)中，经0.8mmol/L的IPTG，30℃诱导5h。原核表达结果表明，Haspi-5和Haspi-6基因均高效表达出融合蛋白，SDS-PAGE显示该蛋白主要以包涵体形式存在，表达条带分子量大小与预测相符，而pET17b-Haspi-10并没有表达出融合蛋白。（3）采用实时定量PCR技术对Haspi-5、Haspi-6和Haspi-10在棉铃虫五龄幼虫各组织部位的转录水平进行了检测，结果表明三个基因在棉铃虫各组织部位均有转录，但在不同组织部位处的表达水平差异显著。Haspi-5

9、基因在表皮中的表达水平最高；Haspi-6基因在头部