棉铃虫serpin基因的克隆、表达及feedingrnai分析

《棉铃虫serpin基因的克隆、表达及feedingrnai分析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、密级：学校代码：10075分类号：学号：20121220理学硕士学位论文棉铃虫Serpin基因的克隆、表达及FeedingRNAi分析学位申请人：孙姣姣指导教师：李继刚教授学位类别：理学硕士学科专业：植物学授予单位：河北大学答辩日期：二〇一五年六月ClassifiedIndex:CODE:10075U.D.C.:NO:20121220ADissertationfortheDegreeofM.ScienceCloning,ExpressionandFeedingRNAiAnalysisofSerpinGenefromCottonBollwo

2、rmCandidate:SunJiaojiaoSupervisor:ProfessorLiJigangAcademicDegreeAppliedfor:MasterofScienceSpecialty:BotanyUniversity:HebeiUniversityDateofOralExamination:June,2015摘要摘要丝氨酸蛋白酶抑制剂是一类最大的、分布最为广泛的蛋白酶抑制剂超家族，它通过抑制丝氨酸蛋白酶活性来集中控制许多重要的蛋白水解级联反应，影响蛋白质的代谢，在生物体中执行多种生物学功能。在昆虫中，丝氨酸蛋白酶抑制剂主

3、要通过调节黑化反应和Toll路径来参与先天免疫反应。在植物中，丝氨酸蛋白酶抑制剂能够阻碍昆虫的生长和发育，是抵制害虫和病原体侵染的重要防御蛋白，因其抗虫谱广和作用机制独特，成为一种新型抗虫蛋白，也成为了植物抗虫基因工程中研究和应用越来越广泛的靶标蛋白。获得棉铃虫丝氨酸蛋白酶抑制剂基因是探究其结构、功能及作用机制的基础。本研究从棉铃虫中克隆出几个全新的丝氨酸蛋白酶抑制剂基因，利用生物信息学技术、实时定量PCR技术和RNA干涉技术对该基因的基本特征、在棉铃虫中的分布及功能进行了初步探究，研究成果如下：（1）通过与已报道的家蚕serpin基因同

4、源比对，利用RT-PCR技术成功克隆到三条与家蚕serpin相似性高的棉铃虫丝氨酸蛋白酶抑制剂基因分别命名为：Haspi-5、Haspi-6和Haspi-10。利用生物信息学技术对Haspi-5、Haspi-6和Haspi-10基因cDNA及其编码氨基酸序列进行了分析，构建了棉铃虫与其它昆虫serpin氨基酸序列的分子系统进化树。（2）利用基因重组技术成功构建了原核表达载体pET17b-Haspi-5、pET17b-Haspi-6和pET17b-Haspi-10，转入大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21(DE3)中，经0.8

5、mmol/L的IPTG，30℃诱导5h。原核表达结果表明，Haspi-5和Haspi-6基因均高效表达出融合蛋白，SDS-PAGE显示该蛋白主要以包涵体形式存在，表达条带分子量大小与预测相符，而pET17b-Haspi-10并没有表达出融合蛋白。（3）采用实时定量PCR技术对Haspi-5、Haspi-6和Haspi-10在棉铃虫五龄幼虫各组织部位的转录水平进行了检测，结果表明三个基因在棉铃虫各组织部位均有转录，但在不同组织部位处的表达水平差异显著。Haspi-5基因在表皮中的表达水平最高；Haspi-6基因在头部的转录水平远远高于其他组

6、织部位；Haspi-10基因在前肠中表达水平最高，中肠的转录水平也相比其他组织较高。（4）成功构建了干涉载体pL4440-Haspi-5和pL4440-Haspi-6，通过活菌饲喂的方式I摘要对棉铃虫二龄幼虫Haspi-5和Haspi-6基因进行RNA干涉。结果表明干涉后棉铃虫致死率有所提高，实时定量PCR检测显示，经RNA干涉处理后，Haspi-5基因在棉铃虫的转录水平明显下降，约降低了6.5倍，而Haspi-6基因转录水平略有下降但并不明显，约降低了1.2倍。关键词棉铃虫丝氨酸蛋白酶抑制剂基因原核表达实时定量PCRRNA干涉IIAbs

7、tractAbstractSerineproteaseinhibitors(Serpins)arethelargestandmostbroadlydistributedsuperfamilyofproteaseinhibitorswhichcancentrallycontrolmanyimportantproteolyticcascadesandaffectproteinmetabolismbyinhibitingserineproteaseactivity,soitperformavarietyofbiologicalfunctions

8、intheorganism.Ininsects,theserpinsparticipateintheinnateimmuneresponsemainlybyadjustingthemelani