桂花ssr引物的开发和scot分子标记体系的建立

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1、单位代码１０４７５■－：Ｖ，．；游护’：＇学号１０４７５３１２０９６８．‘，分类号，．—．貨ＩＩ麵，＾．．义‘呼－；．’．－＇、Ｖ－如皆為义普硕壬学位论文程花ＳＳＲ引物的开发和ＳＣＯＴ分子标记体系的建立＇＇＾４．ｂ＾＼碱．＾＾难；斬，．至ｉ＾．＼＇ａ－＾４．一＊Ｗ一Ａｒ．．．：ｆ．．，一４Ｖ学科：、专业遗传学＇：研究方向植物遠传资源学．１．＇■申请学位类别：理学硕±：｜申请人：马寅峰ｔｙ

2、、；指导教师：尚富德教授袁王俊副教授二〇—五年五月DEVELOPMENTOFSSRPRIMERSANDESTABLISHMENTOFSCOTMOLECULARMARKERSYSTEMINOSMANTHUSFRAGRANSADissertationSubmittedtotheGraduateSchoolofHenanUniversityinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofScienceByMaYinfengSupe

3、rvisor:Prof.ShangFudeandvice-Prof.YuanWangjunMay，2015摘要桂花（OsmanthusfragransLour.），隶属于木犀科（Oleaceae）木犀属（Osmanthus），是我国传统十大名花之一。我国是木犀属植物的分布中心，拥有木犀属和桂花品种国际登录权威，但桂花育种多年来一直进展缓慢。杂交育种是培育优良品种的有效途径之一，然而，桂花从种子萌发到开花需要6-8年的时间，育种周期很长。利用合适的分子标记构建高密度的分子遗传图谱可以鉴定出与表型变异密切相关的标

4、记位点。这些标记可以用于早期育种时的早期选择，有效提高桂花育种的效率，节约成本。SSR（SimpleSequenceRepeat，简单重复序列）标记是基于DNA长度多态性的分子标记技术，该技术检测手段简易且特异性强，成为分析群体遗传结构及构建分子遗传图谱的重要工具。SCoT（startcodontargetedpolymorphism，目标起始密码子多态性）是以植物基因组中ATG位点侧端的保守性来设计引物（单引物），产生与目标基因相关联的多态性标记，其操作简便、可靠性高，目前已成功运用于水稻等多种植物中，是传

5、统的分子标记AFLP、RAPD、SRAP和ISSR等的重要技术补充。本研究拟通过高通量测序（Roche454GSFLX+）开发了足够多的桂花SSR引物，同时构建了其SCoT分子标记的扩增体系，为桂花的分子遗传图谱构建提供技术支持。其结果如下：1.采用高通量测序法开发了桂花的SSR引物。共获得89633条序列片段，利用MISA1.0搜索具有重复单元的序列，primer5.0进行引物设计，最终获得3006条SSR引物，已向GenBank提交1471条。2.目前随机筛选了其中的100对，80对不能检测到条带或不具有

6、多态性，20对具有多态性，且扩增条带清晰。因此有大量的SSR引物可用于构建桂花的饱和分子遗传图谱。3.以2×EsTaqMasterMix预混液为基本体系，针对影响桂花SCoT扩增反应的退火温度、模板用量、引物浓度等因素进行优化，建立了适于桂花SCoT分子标记的体系。从36对SCoT引物中筛选出了可用于桂花的12条SCoT引物。12μL反应体系含有30ng模板-1DNA，引物浓度为0.4μmol.L。不同的引物退火温度分别为48℃、49.9℃、54.3℃或56℃。4.运用该体系对12个桂花品种进行扩增，共得到了

7、244条带，其中多态性条带占238条，多态性比率高达97.47%，每对引物平均扩增出的多态性条带数是19.83条。对SCoT扩增的结果采用UPGMA法进行聚类分析，表明桂花各品种之间的亲缘关系与花色不完I全相关，这与其它分子标记的结果相类似。实验结果表明，本研究建立的SCoT分子标记体系结果稳定，可用于桂花分子遗传图谱的构建。关键词：桂花，SCoT分子标记，引物开发，SSR分子标记IIABSTRACTOsmanthusfragransLour.,Oleaceae,OsmanthusisoneofChina's

8、toptentraditionalflowers.ChinaisthedistributioncenterofOsmanthusspecies,andhasbeenendowedwithinternationalregistrationauthorityofOsmanthusplantsandO.fragranscultivars.Crossbreedingisaneffectivemethodfo