银杏叶提取物对骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化影响的实验研究

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1、银杏叶提取物对骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化影响的实验研究EffectsofGinkgoBilobaExtractontheproliferationandosteogenicdifferentiationofBMMSCs作者姓名：张甲第领域（方向）：口腔修复学指导教师：吴哲教授类别：口腔医学硕士答辩日期：2015年5月29日中文摘要中文摘要银杏叶提取物对骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化影响的实验研究一、研究背景骨质疏松是一种全身性的骨代谢障碍性疾病，它是以骨量减少以及骨微观结构被破坏为特征，致使骨密度降低，骨的脆性增加的一种骨骼疾病。全世界约2亿

2、多人患有骨质疏松，我国有超过8800万人，其中绝大多数为中、老年人，并且以绝经后的妇女占绝大多数，其发病率已跃居常见病多发病的第七位。而颌骨作为骨骼系统的组成部分，其与全身骨质疏松的关系也日益受到重视。颌骨骨质疏松时骨密度下降，生物力学性能降低，致使剩余牙槽嵴骨吸收加速，常造成牙槽嵴牙槽骨高度降低和宽度减小，这些都给义齿的修复造成困难。因此如何采取有效的措施减缓牙槽嵴的吸收、保存拔牙位点是保证后期义齿修复的顺利进行和美学效果实现的关键所在。骨质疏松的治疗有着一段发展史，学者们从不同角度探讨一些药物对骨质疏松治疗疗效，但因其治疗过程中存在的副作用又

3、限制了其临床应用，诸如双磷酸盐容易导致下颌骨坏死（ONJ），激素替代疗法(HRT)易增加血栓、子宫内膜增生以及乳腺癌等疾病的发病率；因此，利用中药及其复方制剂防治骨质疏松已经成为学者们研究的热点。骨质疏松的发生与骨髓中骨髓间充质干细胞（BMMSCs）的分化密切相关，如果BMMSCs较多地向成脂方向分化，那么向成骨分化的细胞数就会相应的减少，进而导致骨质疏松。近年来，许多学者将视线转移到了干细胞治疗上来，骨髓间充质干细胞具有胚胎干细胞的特性，能够多向分化为成骨细I中文摘要胞、脂肪细胞、软骨细胞等，具有良好的细胞生物学特性，是理想的种子细胞，其具有在

4、一定条件下可以诱导为成骨细胞的作用，进而可以促进骨缺损的修复。银杏叶提取物是一种植物性雌激素，植物雌激素在体内具有双向调节作用：在体内雌激素水平较低时有拟雌激素作用；当体内雌激素水平较高时可发挥抗雌激素活性。因此，近年来植物雌激素又被称为“选择性雌激素受体调节剂”，即能选择性地结合体内不同部位和组织的雌激素受体，表现出不同的生理效应。与骨、成骨及破骨细胞等部位的雌激素受体结合，表现出雌激素作用，抑制破骨细胞介导的骨吸收；而与乳腺和子宫内膜部位的雌激素受体结合，则表现出抗雌激素作用，抑制乳腺细胞和子宫内膜上皮细胞的增生。但有关银杏叶提取物中所含的植

5、物性雌激素如何在骨质疏松防治中所发挥的作用还鲜有相关报道。因此本实验通过将不同浓度的银杏叶提取物作用于骨髓间充质干细胞来判断其对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响，并筛选出最佳的药效浓度。二、研究目的本实验通过将银杏叶提取物作用于大鼠第三代骨髓间充质干细胞，探讨其对细胞增殖及成骨分化的影响，从而为骨质疏松的预防及治疗提供一种新的治疗方向。三、研究内容1、分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞选择Wistar大鼠的第3代骨髓间充质干细胞，应用全骨髓法培养骨髓间充质干细胞，并传代纯化细胞，通过鉴定保证实验所用的细胞II中文摘要为具有多向分化潜能的骨髓间充质干细胞

6、2、检测银杏叶提取物对骨髓间充质干细胞增殖的影响将不同浓度的银杏叶提取物作用于第3代骨髓间充质干细胞，分别于培养后的第3天，第5天，第7天进行CCK-8检测其对细胞增殖的影响，并于第7天通过流式细胞仪检测细胞周期。3、检测银杏叶提取物对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响将50,100，150,200，400μg/mL的银杏叶提取物作用于第3代骨髓间充质干细胞，于培养7天和14天分别进行碱性磷酸酶检测，并于14天时进行茜素红染色。在培养1周时进行实时定量PCR检测成骨相关基因BMP-2，Runx2，和Colla1的mRNA的表达。四、实验结果1、将不同

7、浓度的银杏叶提取物和细胞共培养3天、5天、7天后，CCK-8结果显示50，100,150,200,400μg/mL各实验组与对照组之间均未见明显统计学差异。但150μg/mL的浓度可以使细胞较多的处于细胞分裂的S期。2、培养后14天进行茜素红染色，可见除对照组外，50，100,150,200,400μg/mL各组均可见钙结节，且浓度在150μg/mL时钙结节数量较多。在培养7天、14天时分别进行碱性磷酸酶检测，随着时间推移各组碱性磷酸酶的活性均增加，50，100,150,200,400μg/mL各组与对照组相比碱性磷酸酶的活性明显增高，并有统计学

8、差异，且浓度在150μg/mL时作用最明显。3、在培养1周时进行Real-TimePCR检测,浓度为150μg/mL时III中文摘要BM