象耳豆根结线虫侵染能力测定及土壤宏基因组文库杀线虫活性克隆筛选

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1、学校代码：学号：分类号：密级治去大營硕士学位论文题目象耳豆根结线虫侵染能力测定及土壤宏基因组文库杀线虫活性克隆筛选作者张怀军指导教师陈绵才研究员专业植物病理学时间〇一五年五月象耳豆根结线虫侵染能力测定及土壤宏基因组文库杀线虫活性克隆筛选海南大学学位论文原创性声明和使用授权说明原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的作品或成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方

2、式标明。本声明的法律结果由本人承担。论文作者签名：曰期：宇玄月邛曰学位论文版权使用授权说明本人完全了解海南大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。学校可以为存在馆际合作关系兄弟高校用户提供文献传递服务和交换服务。本人授权海南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密论文在解密后遵守此规定。本人已经认真阅读“髙校学位论文全文数据库发布章程”，同意将

3、本人的学位论文提交“高校学位论文全文数据库”中全文发布，并可按“章程”中规定享受相关权益。同意论文提交后滞后：□半年；□一年：二年发布。论文作者签名：碟、日期：年月日海南大学硕士学位论文摘要近年来，象耳豆根结线虫在热带和亚热带地区番石榴园中大规模爆发，给番石榴造成毁灭性的危害和经济损失，己逐渐上升为热带和亚热带地区最重要的根结线虫种类之一。随着现代高效农业的发展，日益增加的温室与设施大棚导致地温不断提高，使象耳豆根结线虫的入侵与扩散成为可能这将给全国的农作物生产带来威胁。因而，弄清其寄主范围和侵染力强弱，并

4、找出高效的防治方法是防止该病害蔓延的关键。通过海南岛各类寄主植物根结线虫种类鉴定，发现象耳豆根结线虫种群已进一步扩散，取代南方根结线虫，而成为我国热带亚热带地区根结线虫优势种群。为了避免化学杀线虫剂施用对环境的污染，本研究运用宏基因组技术，直接从与该线虫发生和防控关系最为密切的根围微生物中筛选杀线虫蛋白酶基因资源，并对其酶的活性做了初步研究，旨在为象耳豆根结线虫的生物防治开辟一条新的途径。具体研究结果如下：象耳豆根结线虫侵染测定。通过温室大棚盆栽番茄，探讨了象耳豆根结线虫最低接种量，以及接种量对个番茄品种侵

5、染差异及生长的影响。研究的结果表明，象耳豆根结线虫对番茄最低侵染起始浓度为条。个番茄品种中，“阿姆斯丹”中抗品种，“中杂号”、“利生一号”、“西粉一号”、“大安吉日”抗病品种；“美国”、“金圣”为感病品种。宏基因组文库构建和筛选。从受象耳豆根结线虫严重侵染的番石榴园中，健康番石榴根围取样，经总提取、纯化、末端修复、连接、包装和转染等过程，构建宏基因组表达文库。特征分析结果表明：该文库库容个克隆，平均插入片段，空载率，包含超过的微生物基因组信息。同时，以脱脂奶为底物，经透明圈表型选择，筛选出含蛋白酶阳性克隆子

6、株，其中株对象耳豆根结线虫具有较强毒杀作用，包括、、、、、、、和，尤以克隆对线虫的毒杀效果最好。含蛋白酶基因克隆子活性探索。以克隆子为研究对象，摇床转数培养温度°是最佳活化条件；摇床转速，培养温度为°时，是克隆菌最适产酶活最佳条件；加入诱导物脱脂奶、诱导剂双重作用下，时，发酵液蛋白吸收值达到最大值。蛋白酶克隆子的初步研究，为蛋白酶基因片段亚克隆、测序、活性蛋白酶分离纯化奠定了基础。对构建和筛选出亚克隆（。通过对基因结构进行了初步分析发现：是一种分泌型胞外蛋白酶，与来自于—的丝氨酸蛋白酶仅有的同源性，有其保守

7、的催化三元组：，和。杀线虫室内生物测定实验表明：克隆发酵液在无需诱导剂，无需克隆载体上的启动子，就能起到杀线虫的作用。说明该蛋白酶基因有独立的启动子，同时，也说明该蛋白酶是一种分泌型胞外丝氨酸蛋白酶。象耳豆根结线虫侵染能力测定及土壤宏基因组文库杀线虫活性克隆蹄选关键词：象耳豆根结线虫；二龄幼虫；接种数量；基因组文库；活性蛋白酶海南大学硕士学位论文，，，，“”、“”、“，“”“，，象耳豆根结线虫侵染能力测定及土壤宏基因组文库杀线虫活性克隆筛选、、、、、、°。，汪，—：；；；海南大学硕士学位论文目录弓目根结线虫

8、危害与防治根结线虫危害分布生物防治研究进展角质蛋白酶在防治根结线虫方面的可行性角质蛋白酶产生菌及其酶基因研究角质蛋白酶研究的可行性角质蛋白酶产生菌的分类角质蛋白酶结构特征以及降解机理实验室角质蛋白酶产生菌发酵酶活比较基于土壤宏基因组文库的角质蛋白酶基因挖掘土壤宏基因组文库活性物质筛选角质酶产生菌在植物病害防治方面的可行性分析。角质酶降解菌在生防应用中可能存在的问题和拟解决方案角质蛋白酶产生菌对植物病害防治展望角质