蚯蚓粪中黄瓜枯萎病菌拮抗细菌的筛选、发酵条件优化及防治效果

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－中图分类号Ｖ学校代侣１０２２４密级公开学号１２０３１０２０１ｉ＾九聲Ｉ嗦石页女学位论文虫丘蝴粪中黄瓜枯萎病菌括抗细菌的筛选、发醇条件优化及防治效果作者王董导Ｕ巧张艳菊教授学位类别农学硕±所在学院农学院￣级学科植物保护二级学科植物病理学二〇－五年六月 独创声明本人寅明所呈交的学位论文是本尺在导师指导下进行的巧究工作及取得的研究成果．。据我巧知除了艾中特别加货标注和致谢的地方诉，论文中不包含其他人己经发表或撰写过的巧究成果．也不哲含未获得＾＇（■适：姑巧有其他帯要特調明的木档巧空）或其化教育机构的学芭或证书与我一隹巧运的村料ｔ同工作的同志巧本巧究所做的任甸贡献巧己在论文中作了昭滿的说巧并表示谢意。学位论文作者签名：：日萌＞／石年弓曰＾７／学位论文版权使用授权书？心用本学位论文作者完全了解学校有关保留、学位论文的规定，学校有权保留并向国家有关部口或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被產阅和借陶。本人、授权学校巧凹将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进巧检索，可巧用影（印、缩印或扫描等复制手段保存、茫编学位论文。保密的学位论文在解密后适用本■授权书）学位论文作者签名：曰期年月、占作巧导师签名若化巾年心月，日坤注：需耍研巧生导师签宇的地方必须导师本人签宇 ClassifiedIndex：Code：10224Confidential(yes/no)：noNO.：120310201DissertationfortheMasterDegreeScreeningofAntagonisticBacterialStrainsAgainstFusariumoxysporumf.sp.Cucumerinum,optimizationofFermentationConditionsandControlEfficiencyCandidate:WangYingSupervisor:ProfessorZhangYanjuDegreeCategory:MasterofAgricultureCollege:NortheastAgriculturalUniversityFirstleveldiscipline:PlantProtectionSecondleveldiscipline:PlantPathologyHarbinChinaJune2015 目录目录摘要...............................................................................................................................................I英文摘要.....................................................................................................................................III1引言...........................................................................................................................................11.1研究目的与意义.................................................................................................................11.2国内外研究进展.................................................................................................................11.2.1黄瓜枯萎病..................................................................................................................11.2.2蚯蚓粪.........................................................................................................................31.3拮抗细菌在植物病害生物防治中的应用现状...................................................................51.3.1拮抗细菌的种类及在生物防治中的应用....................................................................51.3.2拮抗细菌的抑菌机制..................................................................................................71.3.3细菌的分类鉴定方法..................................................................................................82材料与方法.............................................................................................................................102.1黄瓜枯萎病菌拮抗细菌的筛选........................................................................................102.1.1供试材料...................................................................................................................102.1.2试验方法...................................................................................................................102.2拮抗细菌D2的抑菌谱测定.............................................................................................112.2.1供试菌株准备............................................................................................................112.2.2平板抑菌试验............................................................................................................122.3黄瓜枯萎病菌拮抗细菌D2的分类鉴定..........................................................................122.3.1主要试剂、药品及培养基.........................................................................................122.3.2主要仪器设备............................................................................................................122.3.3D2的形态特征观察...................................................................................................122.3.4D2的生理生化鉴定...................................................................................................132.3.5D2的分子生物学鉴定................................................................................................142.4D2发酵条件的优化..........................................................................................................152.4.1发酵液中D2的活菌数量与菌液吸光度的相关性.....................................................152.4.2D2种子液的制备及原始发酵条件............................................................................152.4.3单因子试验................................................................................................................152.4.4培养基优化正交试验................................................................................................162.4.5培养条件的优化试验................................................................................................172.5D2抑菌机制......................................................................................................................182.6D2对黄瓜种子发芽的影响...............................................................................................182.7黄瓜枯萎病的盆栽防效...................................................................................................182.7.1拮抗菌发酵液对黄瓜枯萎病的治疗作用...................................................................182.7.2拮抗菌发酵液对黄瓜枯萎病的预防作用..................................................................18I 东北农业大学农学硕士学位论文2.7.3调查方法...................................................................................................................183结果与分析.............................................................................................................................203.1黄瓜枯萎病菌拮抗细菌的筛选........................................................................................203.2拮抗细菌D2的抑菌谱测定.............................................................................................213.3黄瓜枯萎病菌拮抗细菌D2的分类鉴定..........................................................................223.3.1D2的形态特征观察...................................................................................................223.3.2D2的生理生化特性鉴定............................................................................................233.3.3D2的分子生物学鉴定...............................................................................................233.4D2发酵条件的优化..........................................................................................................263.4.1发酵液中D2的菌体数量与发酵液吸光度的相关性................................................263.4.2培养基成分对D2产量和抑菌活性的影响...............................................................263.4.3培养条件的优化试验................................................................................................303.5D2抑菌机制.....................................................................................................................323.6D2对黄瓜种子发芽的影响...............................................................................................333.7黄瓜枯萎病的盆栽防效...................................................................................................343.7.1拮抗菌发酵液对黄瓜枯萎病的治疗效果..................................................................343.7.2拮抗菌发酵液对黄瓜枯萎病的预防效果..................................................................354讨论........................................................................................................................................374.1蚯蚓粪中筛选生防细菌用于防治土传病害的潜力.........................................................374.2关于拮抗细菌的分离和筛选............................................................................................374.3关于拮抗菌株的鉴定.......................................................................................................384.4关于拮抗菌株发酵条件的优化........................................................................................385结论........................................................................................................................................39致谢........................................................................................................................................40参考文献.....................................................................................................................................41攻读硕士学位期间发表的论文..................................................................................................46II CONTENTSCONTENTSAbstractinChinese....................................................................................................................IAbstractinEnglish..................................................................................................................III1Introduction............................................................................................................................11.1Purposesandsignificance...................................................................................................11.2Researchprogress...............................................................................................................11.2.1Cucumberfusariumwiltdisease..................................................................................11.2.2Vermicompost..............................................................................................................31.3PresentapplicationofAntagonisticBacteriainbiologicalcontrolofplantdiseases............51.3.1Antagonistictypesofbacteriaanditsapplicationinbiologicalcontrol........................51.3.2Inhibitorymechanismofantagonisticbacteria.............................................................71.3.3Methodforidentificationofbacteria...........................................................................82Materialsandmethods..........................................................................................................102.1ScreeningoftheantagonisticbacteriaagainstFusariumoxysporum.................................102.1.1Materials...................................................................................................................102.1.2Methods....................................................................................................................102.2InhibitionofantagonisticbacteriaD2spectroscopy..........................................................112.2.1Preparetheteststrains...............................................................................................112.2.2Flatantifungaltest.....................................................................................................112.3IdentificationoftheantagonisticbacteriaD2...................................................................122.3.1Chemicalreagents......................................................................................................122.3.2Instrumentandequipment..........................................................................................122.3.3MorphologicalidentificationofD2............................................................................122.3.4MainphysiologicalandbiochemicalcharacteristicsofD2.........................................132.3.5MolecularbiologicalidentificationofD2..................................................................142.4OptimizationoffermentationconditionsofD2.................................................................152.4.1RelationbetweenpopulationofbacteriaandOD625....................................................152.4.2Preparationofthebacterialinoculumandtheoriginalfermentationcondition...........152.4.3Singlefactortest........................................................................................................152.4.4Orthogonaltestformediumoptimization...................................................................162.4.5Orthogonaltestforculturalcondition........................................................................172.5ApreliminarystudyontheantibacterialmechanismofD2...............................................182.6Cucumberseedgerminationtest.......................................................................................182.7Thepottedexperimentoffusariumwiltofcucumber........................................................182.7.1Therapeuticeffectonfusariumwiltofcucumber.......................................................182.7.2Preventiveeffectonfusariumwiltofcucumber.........................................................182.7.3Investigationmethod.................................................................................................18III 东北农业大学农学硕士学位论文3Resultsandanalyses...............................................................................................................203.1ResultsofscreeningantagonisticbacteriaagainstFusariumoxysporum.............................203.2InhibitionofantagonisticbacteriaD2spectroscopy...........................................................213.3IdentificationofD2............................................................................................................223.3.1ThemorphologyofD2................................................................................................223.3.2ThephysiologicalandbiochemicalcharatersticsofD2................................................233.3.3ThemolecularbiologicalcharacteristicsofD2............................................................233.4OptimizationoffermentationconditionsofD2..................................................................263.4.1RelationbetweenpopulationofbacteriaandOD625.....................................................263.4.2Orthogonaltestofmediumoptimization......................................................................263.4.3Orthogonaltestofculturalcondition...........................................................................303.5ApreliminarystudyontheantibacterialmechanismofD2.................................................323.6Resultsofcucumberseedgerminationtest.........................................................................333.7Thepottedexperimentoffusariumwiltofcucumber..........................................................343.7.1Therapeuticeffectonfusariumwiltofcucumber.........................................................343.7.2Preventiveeffectonfusariumwiltofcucumber...........................................................354Discussions............................................................................................................................374.1Screeningofbiocontrolbacteriaforthecontrolofsoilbornediseasesinthevermicompostpotential............................................................................................................374.2Isolationandscreeningofantagonisticbacteria..................................................................374.3Identificationofantagonisticstrains...................................................................................384.4Optimizationoffermentationconditionsofantagonisticstrains.........................................385Conclusions.............................................................................................................................39Acknowledgements....................................................................................................................40References..................................................................................................................................41PaperspublishedintheperiodofPh.M.education..................................................................46IV 摘要摘要黄瓜枯萎病是一种真菌土传病害，由尖孢镰孢菌黄瓜专化型引起，具有毁灭性，在全世界范围内发生，且在我国各地区都存在。黄瓜的产量会因为枯萎病而降低10%～30%，糟糕时甚至可达80%～90%，黄瓜生产中，最严重的就是枯萎病，能造成极大的经济损失。黄瓜种植区域连年增长，因此黄瓜枯萎病也越来越严重。所以，对黄瓜枯萎病的防治方法研究已成为生产中的重要问题。目前，药物控制是一个重要的方法防治枯萎病，然而因为缺少效率高、毒性小、没污染的杀菌剂，农药残留会威胁人类的身体健康。因为枯萎病是土传病害，土壤药剂处理面积过大，很难进行，耗资很高。现代社会不断发展，人们越来越重视非污染的绿色食品，并且越来越重视环境保护，生物防治已引起人们的关注。集价格低廉、抑制植物病虫害发生效果显著、同时增加作物产量、提高品质等多种积极作用于一身的蚯蚓粪进入了人们的视野。本研究从蚯蚓粪中筛选对黄瓜枯萎病菌具有拮抗作用的微生物，以期为今后生防菌在黄瓜枯萎病的防治奠定基础。采用稀释平板法，从新鲜蚯蚓粪中分离到374株细菌。筛选出对黄瓜枯萎病菌有拮抗活性的菌株28株，其中以D2的抑菌效果最好，抑菌直径达28.28mm，且抑菌效果稳定。D2单菌落形态为圆形或近圆形，扁平状，中等大小，表面光滑，不透明。革兰氏染色为阴性。菌体杆状，不产生芽孢，（0.5~1.0）um×（1.5~4.0）um。在4℃不生长，41℃可以生长。在NaCl浓度小于5%时可生长，大于7%时不生长。不产生荧光，可使明胶液化，可分解淀粉。D2的分子生物学鉴定中，得到目的片段大小为1462bp，将得到的PCR产物测序结果和Genbank里的序列进行同源性比较，显示该菌株为洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderiacenocepacia）。对D2的发酵培养基成分和培养条件进行了优化，筛选出最佳实验室发酵配方：酵母膏1%，蔗糖0.5%，NaCl0.3%，NH4NO30.3%；最佳培养条件：发酵温度30℃，培养基pH6.0，接种量2.0%，装液量为100mL的三角瓶中装液40mL。D2发酵液优化条件下的对黄瓜治疗试验，D2稀释50倍时防效达70.48%，稀释100倍时防效达69.89%，稀释150倍时防效达69.58%，多菌灵防效达78.09%，D2稀释50倍防效仅次于多菌灵的防效。D2发酵液对黄瓜枯萎病预防试验，D2发酵液稀释50倍时，防治效果达到77.82%，稀释100倍时，防治效果为77.56%，稀释150倍时，防治效果为76.52%，多菌灵防效达70.59%，D2发酵液稀释50倍时防效比多菌灵的防效多7.23个百分点。关键词黄瓜枯萎病；生物防治；拮抗细菌；16SrDNA鉴定；发酵条件优化I AbstractScreeningofAntagonisticBacterialStrainsAgainstFusariumoxysporumf.sp.Cucumerinum,optimizationofFermentationConditionsandControlEfficiencyAbstractCucumberfusariumwiltdiseasecausedbyFusariumoxysporumf.sp.cucumerinumisaworldwidedestructivesoilbornefungaldiseases,occurredinalloverchina.Wiltcancausecucumberyielddecreasedby10%~30%,severeupto80%to90%,whichisthemostseriousdiseaseofcucumber,causedoneofthebiggesteconomiclossdiseases.Withthecucumberplantingareahasexpandedeachyear,resultingincontinuouscroppingcucumberfusariumwiltdiseasecauseisincreasing.Therefore,in-depthstudyoftheeffectivepreventionandcuremethodsofcucumberfusariumwiltdiseasehasbecomeanimportantproblemtoberesolvedatpresent.Atpresent,chemicalcontrolisanimportantmethodtocontrolcucumberfusariumwilt,butduetothelackofefficient,lowtoxicity,nopollutionoffungicide,easycausepesticideresidues,harmpeople'shealth.Duetocucumberfusariumwiltassoil-bornediseases,drugtreatmentisdifficulttoimplementalargeareaofsoilandthecostishigher.Withthedevelopmentofmodernsociety,peoplepaymoreattentiontothestrongdemandandprotectionoftheenvironmentforpollution-freefood,biologicalcontrolhasarousedgreatattention.Setlowprice,suppressplantdiseasesandinsectpestssignificanteffect,whileincreasingcropyieldsmanypositiveroleinimprovingthequalityofonevermicompostenteredpeople'sfieldofvision.Screeningantagonistictoplantdiseasemicroorganismsfromvermicompostonplantgrowth,playstheroleofplantdiseasesandinsectpestspreventionandcontrol.Atotalnumberof374bacterialstrainswereisolatedfromfreshvermicompostbytubedilutionassay.Theresultofplatetestshowedthattwenty-eightstrainshadantagonisticactivityagainstcucumberfusariumwilt.Accordingtotheresultsofthesuppressionassay,strainD2wasselectedasoneofthebesteffect.Theinhibitingdiameterwas28.8mmandtheinhibitoryeffectisstable.D2singlecolonieswereroundornearlyround,flat,mediuminsize,smoothsurface,opaque.Gramstainwasnegative.Cellfunction,itdoesnotproducespores.Scanningelectronmicroscopeshowedstraightrod-shapedbacteria,（0.5~1.0）um×（1.5~4.0）um.Donotgrowat4℃,41℃canbegrown.D2growthinNaClwaslessthan5%,D2cannotgrowinNaClwasmorethan7%.D2doesnotproducefluorescence,itcanmakethegelatinliquefaction,degradablestarch.IdentificationofmolecularbiologyofD2,obtainthetargetfragmentsizewas1462bp,thePCRproductsweresequenced,sequencereportedinGenbanksequencingandhomologycomparison,itwasprovedfortheBurkholderiacenocepacia.TheoptimalfermentationmediumcomponentsandthebestoptimalfermentationconditionsIII 东北农业大学农学硕士学位论文forstrainD2werestudied.Theresultswereasfollows:themediumoffermentationforD2constitutedof1.5%ofyeastextract,0.3%ofsucrose,0.3%ofsodiumchloride,0.5%ofammoniumnitrate.Thefermentationconditionswere:culturaltemperature30℃,optimuminitialpH6.0,inoculationseedliquid2.0%andloadingliquid40mLin100flasks.OptimizingconditionsofcucumberfusariumwilttreatmenttrialfermentationbrothofD2,D2diluted50times,thepreventiveeffectwas70.48%,diluted100times,thepreventiveeffectwas69.89%,150folddilution,thepreventiveeffectwas69.58%andcarbendazimpreventioneffectwas78.09%.TheantieffectofD2diluted50timeswaslowerthancarbendazimcontroleffect.D2fermentationliquidoncucumberfusariumwiltdiseasepreventiontrials,D2fermentationbrothdiluted50times,thecontroleffectreached77.82%,diluted100times,thecontroleffectis77.56%,diluted150times,thecontroleffectwas76.52%andcarbendazimpreventioneffectwas70.59%.ThepreventiveeffectofD2fermentationbrothdiluted50timeswas7.23percentagepointshigherthancarbendazimcontroleffect.Keywords:cucumberfusariumwiltdisease;biocontrol;antagonisticbacteria;16SrDNAidentification;optimizationoffermentationconditionsCandidate:WangYingSpeciality:PlantPathologySupervisor:ProfessorZhangYanjuIV 引言1引言1.1研究目的与意义黄瓜枯萎病是一种世界级的摧毁性土传真菌病害，黄瓜病害中，最严重的就是枯萎病，能造成极大的经济损失。黄瓜种植区域连年增长，因此黄瓜枯萎病也越来越严重。目前，药物控制是一个重要的方法防治枯萎病，然而因为缺少效率高、毒性小、没污染的杀菌剂，农药残留会威胁人类的身体健康。现代社会不断发展，人们越来越重视非污染的绿色食品。减少化学农药的使用、使用生物有机肥和生物农药对蔬菜的食用安全性、生态环境的稳定性极为重要。因此选出一种可以代替化学农药、自然条件即可获取的生物质成为当下生物防治研究人员的首要任务。蚯蚓粪是蚯蚓对其生活环境周围的有机质进行利用和降解的产物，家畜禽类的排泄物经过蚯蚓粪的处理，既可以有效利用生物质能源，降低环保中投入的资金，又能够显著减少废弃物里病原菌的数目[1]。蚯蚓粪中含有丰富的细菌、放线菌和真菌，对部分植物病害有一定的防治作用。但蚯蚓粪在生活中较难获取，因此从蚯蚓粪中筛选出对植物病害病原菌具有拮抗作用的微生物为生物防治提供了新的可能性。本研究的目的是从蚯蚓粪中筛选出对黄瓜枯萎病菌（Fusariumoxysporumf．sp．cucumerinum）有较强抑菌作用的拮抗细菌，优化其发酵条件，鉴定其分类地位，研究其对黄瓜枯萎病的防治效果，为扩大生产以及进一步开发有关蚯蚓粪的系列优质高效农化产品提供有力的理论依据。1.2国内外研究进展1.2.1黄瓜枯萎病1.2.1.1黄瓜枯萎病的症状及危害黄瓜枯萎病是一种真菌土传病害，具有毁灭性，在全世界范围内发生[2]。黄瓜枯萎病也叫蔓割病、萎蔫病等，在中国各地都能发生。萎蔫是黄瓜枯萎病的明显特征。在黄瓜整个生长时期都可以感染，开花、抽蔓和结果时感染最厉害。得病后，黄瓜植株减缓了生长速度，进而从根部到茎部变得萎蔫。地面处或者根茎部的叶子首先得病，中午时分会出现少量叶子萎焉，早晨晚上会恢复正常水平，好像缺水样子，叶子颜色变浅，慢慢变化并且整个植株死亡。后期的病株，茎基部表皮变成纵裂，节部和节间有黄褐色的条状斑点，甚至差时会腐烂[3]。雌花接触病原菌、花瓣烂掉，还会有灰浅褐色的变质层，然后幼瓜发病，小瓜脐部是水渍状，小花发软、萎蔫、烂掉，表面都是霉层。黄瓜的产量会因为枯萎病而降低10%～30%，糟糕时甚至可达80%～90%，黄瓜病害1 东北农业大学农学硕士学位论文中，最严重的就是枯萎病，能造成极大的经济损失[4]。黄瓜种植区域连年增长，因此黄瓜枯萎病也越来越严重。所以，对黄瓜枯萎病的防治方法研究已成为生产中的重要问题[5]。1.2.1.2黄瓜枯萎病的病原黄瓜枯萎病的病原菌是尖孢镰孢菌黄瓜专化型(Fusariumoxysporumf．sp．cucumerinum)，气生菌丝，多且白，在PSA培养基上有浅青紫色或者浅褐色绒霉，卵状的小型分生孢子，透明，单孢或者双孢，大小（7.5~20.0）μm×（2.5~5.0）μm；纺锤状或者镰刀状的大型分生孢子，透明，1~5个隔膜，3个隔膜挺多，上部细胞长，渐细，底部倒圆锥截状，大小，1个隔膜的（12.5~32.5）μm×（3.75~6.25）μm，2个隔膜的（21.3~32.5）μm×（5.0~7.5）μm，3个隔膜的（27.5~45.0）μm×（5.5~10.0）μm；厚垣孢子是顶生或者间生，球形，浅黄色[6]。1.2.1.3黄瓜枯萎病的发病规律黄瓜自始至终均能感染枯萎病，结黄瓜后感染更重了，是最厉害的时期。菌丝，厚垣孢子与菌核侵入苗，根部有伤口或者根毛顶端的细胞都能导致病菌进去。黄瓜苗根部茎部有小伤，所以较易得病。病菌找到寄主的初期在细胞间或者细胞里进行扩增，接着是中柱进到木质部，在导管里面发育生长，让导管不顺畅，让黄瓜植株吸收及运输水分的功能丧失，水分的输送受到障碍，引发组织坏死[7]，最后使得黄瓜植株枯萎而死亡[8]。黄瓜枯萎病菌的传播途径主要有土、有机质与种子等，孢子可在土病残体和未经腐熟的带菌肥料里过冬。厚垣孢子能够10年多在土里有生命力，没有寄主，也可保持5～8年的生命力，厚垣孢子的生活力相当强，短时期里不会死，甚至在种子表皮也可以过冬。若施有机肥料，伤及植株的根或者因为田地操作错误弄了伤，病菌侵入就会非常容易了，也就发生了病害[9]。枯萎病菌存活长，并且病苗在别的农作物与杂草之间也能互相感染，它是没病症带菌的寄主，有菌率最高的就是根部了。一般情况下，连续种植区域得病很重，保护地发生的特别多。温度20～30℃、相对湿度85%特别容易有病。而且，土壤pH为5～7或者有线虫困扰的区域，得病情况也不乐观[10]。1.2.1.4黄瓜枯萎病的防治黄瓜枯萎病的防治包含选用抗病品种，轮作种植、种子灭菌、土壤灭菌、嫁接防病和化学防治等方式[11]。化学防治多数使用多菌灵、甲基硫菌灵等药剂[12]。现在，化学防治是防控黄瓜枯萎病的主要办法，但是药剂的使用让农药残留严重，威胁人类的身体健康。因为枯萎病是土传病害，土壤药剂处理面积过大，很难进行，耗资很高。现代社会不断发展，人们越来越重视非污染的绿色食品，并且越来越重视环境保护，生物防治已引起人们的关注[13]。拮抗微生物和它的代谢物质防治植物病害，这个就是生物防治。生物防治的首要任务是筛选出生防菌。2 引言1.2.2蚯蚓粪生物学家达尔文就曾经说过“蚯蚓粪以外没有沃土”。蚯蚓的消化道可以产生很多有益的微生物还有分解蛋白质、脂肪、碳水化合物与纤维素的酶类，蚯蚓吃掉有机废弃物以后，经过消化道的研磨及挤压，排出蚯蚓粪。所以说，蚯蚓粪就是蚯蚓对有机废弃物进行了生物降解的结果[14]。蚯蚓粪也是把植物营养、生物激素、植物保护结为一体的优质肥料。使用蚯蚓粪处理有机废弃物，生产的蚯蚓粪不但是含有植物所必要的营养物质的优秀肥料，更加重要的是，蚯蚓粪它是微生物、植物激素等活性物质的运载体与基质，若按生态学原理专门把蚯蚓粪这样高效的土壤调节剂加进到农业生态系统里去，就等同于加入了丰富的、含高效经济效益的生物群体，填满了空白的生态位，系统能很稳定。安稳的结构是功能高效的前提，农业生态系统的经济效益和社会效益等会同样地得到提升。蚯蚓粪用在植物病害的防治也是最近这几年才开始进行的。把蚯蚓粪加入到作物种植里，能够达到减少化学农药使用剂量，促进植株生长发育，增多产量，改良品质，减少病虫害发生的目的。因为化学杀虫剂及杀菌剂不恰当的施用，导致了部分环境问题，像在消灭自然和农业生态系统里的有害生物的同时，同样消灭了非有害生物，而残留的有毒物质进入到食物链里，并在部分生物体内积累。它不只给环境有了非常大的压力，同样给人类的身体健康带来威胁，并给可持续农业的发展策略提出了挑战[15]。1.2.2.1蚯蚓粪的物理性质蚯蚓粪是一种发黑色、不发霉、不腐烂、没臭味、质地均匀、有土味的小颗粒物。它的孔性、排水性、高持水量特别出色[16]。蚯蚓粪的物理特质也就是有机废弃物与蚯蚓的消化程度组成的，蚯蚓粪拥有非常大的表面积，因此，很多微生物共存，可以很好地吸收营养物质并保存。此时，通过了蚯蚓的消化，有利于蚯蚓粪里水稳星团聚体的组成。蚯蚓粪的水稳性通常比非蚯蚓粪组成的团聚体高[17]。1.2.2.2蚯蚓粪的化学性质蚯蚓粪含有植物生长中所需要的氮、磷、钾，和铁、猛、铜、硼等多种的微量元素，还富含有多种的氨基酸。有关研究表示[18]，蚯蚓粪的矿物质含量比原料牛粪的要高，尤其是铁、猛、锌、铜、铝等微量元素；有多种多样的必需氨基酸。蚯蚓粪里不但有植物生长必需的部分营养元素和微量元素，并且它的含量都非常高，是植物便于吸收的形态，比方可溶性磷，硝态氮与交换性钾、钙、镁等[19]。因为蚯蚓粪的化学性质很优越，把它用做肥料。蚯蚓粪和蚯蚓饵料对比可知，蚯蚓粪的可溶性盐多、阳离子交换性能以及腐殖酸显著增多，有机部分变化成稳定的复合物质[20]。使它具备吸附能力好、保肥供肥性能良好、稳定性很高等特点，且电导率与重金属含量则很低。有机废弃物通常呈碱性，当蚯蚓处理有机废弃物，经过蚯蚓的消化，因为微生物的新陈代谢则产生了有机酸，让原材料pH值降低，偏向于大部分植物生长所要的最适pH值[21]。制造蚯蚓粪的原料不同，蚯蚓粪里的营养物存在差异，并且也跟蚯蚓活性关系密切[22]。3 东北农业大学农学硕士学位论文1.2.2.3蚯蚓粪的生物学性质蚯蚓粪里的细菌、真菌还有放线菌十分多。里面的微生物同样参与到有机废弃物的处理中，导致各种各样的物质矿化成对植物有用的物质，同时合成有生物活性的物质。它里含有很多的植物激素，比如赤霉素、生长素等，帮助植物的新陈代谢，效果显著，对植物的发育以及作物的品质有影响。蚯蚓粪里的腐殖酸，影响营养吸收、蛋白质合成具备荷尔蒙性质的物质。因为蚯蚓粪里营养物质十分丰富，排出的蚯蚓粪在第一周里细菌的数量是会加倍增多[23]。蚯蚓的分泌物里含有氨基酸、多糖类与生物酶等，它为微生物生长提供营养物质，并且蚯蚓的消化道变成部分微生物繁殖的温室，致使微生物的数量快速增多。蚯蚓可以降低因为病原真菌引发的病害，在经过蚯蚓消化道时，和食物一起进到体内的真菌营养体和大多数细菌都死了，真菌孢子与一些细菌还存活。蚯蚓食物包括真菌，有的消化酶可能是从微生物那里得来，所以微生物对蚯蚓有机物的吸取表现了十分重要的作用。1.2.2.4在防治土传病虫害方面的研究蚯蚓粪里含有很丰富的微生物群体，从蚯蚓粪里筛选出对植物病害具备拮抗作用的微生物，使它在植物生长里起到对病虫害的预防和治疗的作用。现在，国内外从蚯蚓粪里筛选出对植物病害具备拮抗作用的微生物的报道还很少。Arancon等(2002)[24]发现加入蚯蚓粪能强烈降低寄生线虫的数目，减少感病率。胡艳霞(2002)[25]从微生物彼此的拮抗作用开始，从通过蚯蚓处理过的牛粪里分离得到几株拮抗性比较强的菌株，它的发酵液对几种植物病害都有很好的拮抗作用。同时用黄瓜做实验，得到结果，蚯蚓粪能够诱导植株的系统抗性，来提升植株的免疫力，从而达到植物病害防治的目的。胡艳霞等(2004)[26]成功地从蚯蚓粪里分离得到拮抗强、抑菌谱广的拮抗微生物。蚯蚓粪能够诱导黄瓜产生炭疽病抗性，蚯蚓粪触发黄瓜体内的防卫酶系，诱使产生系统抗性，从而控制病害，从此初步回答了蚯蚓粪的抗病机制。Arancon等(2006)[27]知道加上一些蚯蚓粪能够强化草莓抗病性，使草莓抵抗病原菌与线虫。孙燕霞等(2009)[5]从蚯蚓粪与黄粉虫沙里筛选出对尖孢镰孢菌具备拮抗作用的菌株，并且进行了紫外线的诱变处理，得到突变菌白地霉的变种。刘雪连等(2011)[28]从蚯蚓粪里分离得到54株具备产酸性能的菌株，里面6个菌株对大肠杆菌具备拮抗作用。汪学军等(2015)[29]从蚯蚓粪里筛选得到16株对指示菌具备抗菌活性的放线菌，此研究为下一项分离抗菌物质用在生物防治提供理论基础。蚯蚓粪还能减少化学农药的使用数量[30]。1.2.2.5作为除臭剂蚯蚓粪也能当作养殖场的除臭剂[31]。加入蚯蚓粪可以减少猪粪便里对甲酚与挥发性脂肪酸的量，猪粪便厌氧发酵后，粪便里臭气化合物的含量减少显著[32]。蚯蚓粪可以控制鸡粪里的氨气、硫化氢的产生，具备除臭的作用，效果十分明显，而且对产生臭味的菌具备显著的抑制与消灭作用[33]。蚯蚓粪拥有高孔隙率还有比表面积，高效吸收臭气；蚯蚓粪里微生物极多，可以很好的4 引言吸取纯化臭气物质[34]。1.2.2.6其它作用Arancon等[27]表明蚯蚓粪能够影响氮循环速度与产生植物生长激素，是通过微生物数目与活性的提升，它可以明显的促进草莓的生长发育，提高草莓的产量。土里蛋白酶、脲酶因为蚯蚓粪的加入活力加强，还升高了土的肥力。Atiyeh将蚯蚓粪中的腐殖酸加到栽培物里，番茄和黄瓜的株高、叶大小与根干重等指标显著升高了[35]。加了蚯蚓粪，草莓果重变化很大，变重，又能改变草莓品质，配合加了蚯蚓粪处理过的肥料，效应比对照处理与单加NPK化肥处理要好得多[36]。蚯蚓粪当做育苗与栽培基质的研究特多，都表现出蚯蚓粪具备促进植物生长、提升产量及改变品质的作用，还可以克服果蔬连作障碍。所以，蚯蚓粪十分适合在设施栽培里应用。利用蚯蚓粪当育苗基质来育苗，能明显提升秧苗的质量，减少育苗时间，有利于壮苗和工厂化育苗[37]。在蚯蚓粪复合基质里的万寿菊种子发芽速度十分地快，幼苗的根系表现很好，蚯蚓粪和蛭石比为3:1的基质作为万寿菊批量育苗的有机基质配方最适合[38]。我们可以看出，在育苗基质里加进去恰当比例的蚯蚓粪，能显著提升秧苗的质量且减少育苗的时间，有利于培育壮苗和批量育苗。蚯蚓粪还能作为配合饲料[39]、提升厌氧发酵[40]、吸取重金属[41]与减少果实里重金属残留[42]等作用。1.3拮抗细菌在植物病害生物防治中的应用现状生防细菌资源相当丰富，因为它具备对环境友好的优点使它变成植物病害防治技术研究的热点。细菌的品种多、繁殖速度快、多种代谢产物、短的生活周期并且培养便利等好处，在植物病害防治的实验中应用特多。国内外广泛利用拮抗微生物和它的代谢产物来抑制病原菌的生长及活动，其中拮抗细菌在植物病害防治里起到至关重要的作用。它的主要优势是：细菌的类别和数量繁多，在植物的根际以及地上部大量的存在；细菌对病原菌的作用方式很多，可以通过竞争、拮抗、寄生以及诱导植物发生抗性等方式对病原菌产生影响；细菌具备令人惊讶的繁殖速度，大部分能够人工培养，利于控制，在实践中便于操作；部分细菌不但能防治病害且能够增加作物产量[43]。1.3.1拮抗细菌的种类及在生物防治中的应用1.3.1.1芽孢杆菌(Bacillussubtilis)当今国内外利用芽孢杆菌来防治植物病害相当广泛，比如马铃薯疮痂病、番茄青枯病、苹果红腐病、小麦赤霉病和其它一些土传及地上部的病害，防治这种病害的拮抗菌是营腐生生活的革兰氏阳性细菌，可内生芽孢，抗逆境能力强，繁殖速度快，营养简单，便于定殖于5 东北农业大学农学硕士学位论文植物表面[44]。用于生防的芽孢杆菌种类有枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、多粘芽孢杆菌(B.Polymyxa)、蜡状芽孢杆菌(B.cereus)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)和短小芽孢杆菌(B.pumilis)等。因为芽孢杆菌有抑制植物病害的能力，同样是自然界中广泛存在的非致病细菌，对人和畜无害，不会污染环境，所以备受各国的研究人员青睐。在外国利用枯草芽孢杆菌(B.subtilis)防治由水稻纹枯病菌(Rhizoctoniasolani)、腐霉菌(Pythiwnspp.)、镰刀菌(Fusariumspp.)导致的病害，取得比较好的效果[45]。澳大利亚研制的枯草芽孢杆菌A-13对麦类和胡萝卜立枯病和其它的土传病害具备比较好的防治及增产作用[46]；赵百鸽等[47]用枯草芽孢杆菌B-903防治苹果轮纹病，得到了很好的效果；范青等[48]研究报道，枯草芽孢杆菌B-912对桃及油桃褐腐病的抑制效果显著；林福呈等[49]从西瓜根际分离到的3个枯草芽孢杆菌菌株对西瓜枯萎病菌大、小分生孢子的萌发及芽管的生长都有显著的抑制作用。童蕴慧等[50]分离的多粘类芽孢杆菌W3菌株，对灰霉病菌有很强的拮抗活性及定殖能力，并且它可以诱导番茄植株对灰霉病发生系统抗性，最大诱抗效果可到64.5%。傅学池等[51]从苹果树枝、叶、果分离到短芽孢杆菌对苹果斑点落叶病防效达70%，而且有促进果树生长及果实着色的作用。1.3.1.2假单胞杆菌(Pseudomonasspp.)Pseudomonasspp.作为生防因子得到了国内外众多研究者的广泛注意。20世纪70年代，美国加州大学首先研究了该菌，当时便得到了广泛关注。Burv等[52]（1987）报道P.Fluorescens及P.pudita用在马铃薯种薯上能够促进马铃薯的生长，现在已经在甜菜及萝卜上得到了证明。Imlor[53]等用syringacin4-A的粗提液（由P.syringaepv.syringae4-A产生）喷雾在菜豆叶片上防治由Pseudomonasphaseolicola引发的叶斑病，用它浸种大豆可免受Pseudomonasglycinea的侵害，而且能促进种子萌发。Pseudomonas属的细菌不只对植物有促生的作用，且还能抑制病害，这个细菌广泛生长在于植物的根周和叶周，土壤里主要是是不一样类型的荧光假单胞杆菌[54]，用的最多的品种有荧光假单胞杆菌、洋葱假单胞杆菌及恶臭假单胞菌。它们和草生欧氏杆菌的一些菌株抑制植物的气生位置病害。用荧光假单胞杆菌JF1（P.fluorescentJF1）对花生的种子进行浸泡接种，能够显著抵制土壤中青枯菌（Ralstoniasolanacearum）的侵染。荧光假单胞杆菌M18（P.fluorescentM18）用于防病时，不但可以抑制病害而且能够促进植物的生长[55]。进一步研究显示，黄瓜的根围比番茄的根围更利于该菌定殖。铜绿假单胞杆菌ZJ1999（P.aeruginosaZJ1999）防治水稻纹枯病，它的粗提液稀释至10倍以后，对病原菌还有抑制作用[56]。楼兵干等[57]研究知道用铜绿假单胞菌CR56处理种子，能很好的防治因为腐霉及茄丝核菌导致的黄瓜及番茄的猝倒病。1.3.1.3放射性土壤农杆菌(Agrobactriumradiobacter)Kerr等防治由根癌土壤杆菌引起的果树冠瘿病使用放射性土壤农杆菌K84在细菌作为生防菌成功应用尚属首次，且在各个国家宣传[58]。而且该细菌对对桃、苦扁桃根肿病同样有极好的防治疗效，把它用于花的根部土壤里，癌肿病原的蛋白质和细胞壁的合成受到妨碍，因此根癌肿病可以预防。6 引言最近几年，关于放射性土壤农杆菌的研究有了新发现，深入说明K84菌株对生物II型及生物III型土壤农杆菌的拮抗作用，对葡萄的生物III型细菌是没有用的，但是可以完全防治核桃根癌病，同时研制出了K84生物农药根癌宁[59]。此外，原来有报道能分泌几丁质的节杆菌能防治香石萎蔫病，它是由石竹尖镰孢引起的，还能防治小麦全蚀病，它是由小麦全蚀病菌所致的。1.3.1.4巴氏杆菌（Pasteuriaspp.）巴氏杆菌是用于防治线虫病害的拮抗菌之一[60]，现在很多研究人员正在研究中。另外，巴氏杆菌的内生细菌还能够缓解冻害[61]。1.3.2拮抗细菌的抑菌机制1.3.2.1竞争作用为什么部分细菌对种植的作物具备防病作用，主要是因为部分细菌具备比植物病原物更超强的竞争能力，夺取营养物质，物理位点及生物学位点的抢夺，氧的竞争等[62]。这里面营养物的竞争包含氮、磷及铁的竞争[63,64]。比如在树木气生部生长的细菌，草生欧氏杆菌会和梨火疫病菌发生竞争营养，表现是草生欧氏杆菌消耗了植物表面的氮化合物养分[65]。再比方荧光假单胞杆菌产出的抑菌活性物-嗜铁素，它对铁具备极好的亲和性，可螯合铁，在铁的运转中起到作用，使铁变少，让病原菌无法生长[66]。1.3.2.2拮抗作用是指因为细菌的同化作用产生可以抑制有害病原物发生扩展的抑菌物，通常在较低浓度下就可以对病原菌的生长及代谢产生抑制，引发细胞内溶现象，包括有细菌素、蛋白酶等。1.3.2.3寄生或“捕食”作用部分细菌能侵袭到植物病原物体内，从里面获得营养，来生存及繁殖。常用吸附生长、缠绕、侵入、消解等各种方式抑制病原菌。1.3.2.4诱导植物产生抗性生防微生物和植物在长时期自然进化当中形成了一种特别的防卫系统，当植物遇到有害微生物侵袭时可以被诱导，从来发动一系列的精细、复杂的防御反应，减缓或者消灭危害的发生，就是诱导抗病性。此抗病机制是Ross在20世纪60年代展开研究的[67]。外国利用没毒青枯菌（Pseudomonassolanacearum）突变体对西红柿的幼苗及土豆的块茎进行处理，西红柿与土豆皆表现有抗性[68]。中国对诱导抗性的研究开始比较晚，但是同样得到了一些成果[69]，过去有科研人员用根癌细菌(Agrobacteriumtumefaciens)对已经形成肿瘤的雏菊(BellisperennisLinn.)来进行接种，研究人员发现又接种相同种菌也不可形成新的肿瘤[70]。拮抗细菌通过以上的抑菌机制，可以使病原菌产生畸形、产生泡状物，损坏病原菌的细胞壁、引发细胞内含物外流，一些使菌丝扭曲、原生质凝集、生长点变大、细胞壁破损、菌丝瓦解，从而对孢子的萌发产生部分抑制作用[71]。7 东北农业大学农学硕士学位论文1.3.3细菌的分类鉴定方法1.3.3.1传统鉴定方法（1）菌落形态学鉴定主要是观察在培养基上的菌落生长状况，包含在固体培养基上菌落的形状、大小、颜色，菌落的表面和边缘特点；液体培养时候的浑浊程度，能否形成沉淀，液面可否形成菌膜；以及半固体培养基穿刺接种后能否顺着接种线生长和它的生长状态[72]。（2）菌体形态学鉴定用显微镜观看菌体基本的形态结构、大小、排列形式、菌边形状、有无两端染色，能否形成芽孢与荚膜。（3）生物化学鉴定特地对细菌的生长过程里所发生的特殊代谢物，采取特殊生化试剂来测定，来鉴定细菌的类别。如糖(醇)类的氧化发酵实验，脂酶类实验，产生某个气体试验等[73]。（4）血清型鉴定依据细菌具备相对特异性抗原构造的特征进行微生物鉴别的方法，这个鉴别方法能够鉴定到细菌的种与型。（5）细菌毒力测定不相同病原菌或者同种类细菌不同的型或者株，毒力通常不相同。用LD50或者ID50表示毒力。毒力的测定用于鉴别较有代表的特殊菌株。1.3.3.216SrDNA鉴定方法由于分子生物学的快速发展，尤其是Mullis在1986年发明PCR技术来，细菌的分类鉴别也是从传统地表型分类进行到各种各样的基因型的分类水平。rRNA因为它的含量大、高度保守的特征变成细菌分类地位鉴别最经常研究的分子。原核生物的rRNA分成3种，分别是5SrRNA、16SrRNA与23SrRNA。里面经常使用的16SrRNA片段具备以下特征：（1）多拷贝。16SrRNA在大部分原核生物当中都具备多个拷贝，拷贝数从1到14不同，使得它能够比较好的进行测试。（2）多信息。16SrRNA地可变区和保守区交叉排列。所以，可以依据保守区所含有的基因信息设计不同细菌的通用引物，同样能依据可变区基因信息设计特别细菌地特异引物或者探针。因为细菌不一样种的16SrRNA基因可变区所包含信息不一样，让测试具备特异性。（3）长度适中。16SrRNA1500bp编码基因大概含有50个功能域，里面进行16SrRNA序列测试已经变成细菌种属鉴定与分类的标准方式，大概2500个种的16SrRNA全序列早已报道出来。依据其同源性，早已构建各种属的系统发育树[74]。当下，16SrRNA鉴别方法已是细菌分类鉴别里的公开承认方式。16SrRNA序列分析可以鉴别到细菌种的水平，这个是其它鉴别方式达不到的[75]。然而16SrRNA鉴定细菌的种类仍然存在某些问题。第一可供参考的数据库并不完整。因为16SrRNA鉴定方法开始发生的时间很短，细菌种类又在不断地变异之中，虽然数据库在不断地扩大细菌种类，但是仍就能发生特殊的情况；此外，因为开始地实验方式不太精准，前8 引言期鉴别的数据库里难免可以出现序列不对的地方，部分序列里还有不明确的位点；第二，现在还比较难以精准地测定基因突变的速度。以上都是16SrRNA鉴别方式现在面临的部分亟待解答的问题。9 东北农业大学农学硕士学位论文2材料与方法2.1黄瓜枯萎病菌拮抗细菌的筛选2.1.1供试材料2.1.1.1供试蚯蚓粪新鲜蚯蚓粪来自双城市杏山镇顺利村。2.1.1.2供试黄瓜品种感病品种东农649，由东北农业大学黄瓜课题组提供，用于拮抗菌株皿内促生和盆栽防效试验。2.1.1.3黄瓜枯萎病菌尖孢镰孢菌由东北农业大学农学院植物病理实验室提供。2.1.1.4培养基NA培养基：牛肉膏3g，蛋白胨5g，琼脂粉20g，蒸馏水1000mL，pH7.0~7.2，121℃下高温蒸汽灭菌30min。用于分离培养细菌。NB培养液：牛肉膏3g，蛋白胨5g，蒸馏水1000mL，pH为7.0，用250mL三角瓶分装，每瓶100mL，121℃下高温蒸汽灭菌30min。用于细菌发酵培养。PDA培养基：200g土豆，蒸馏水1000mL，20g葡萄糖，20g琼脂粉，121℃下高温蒸汽灭菌30min。用于黄瓜枯萎病菌培养、拮抗试验和菌株的保存。2.1.1.5药品琼脂粉，葡萄糖，蛋白胨，牛肉膏等。2.1.1.6仪器设备TOMYSX-500型脚踏式高压蒸汽灭菌器（日本），HPG-280光照培养箱（哈东联），HZQ-Q全温振荡器（哈东联），1/1000g电子天平，超声波破碎仪等。2.1.2试验方法2.1.2.1蚯蚓粪中拮抗细菌的初筛将蚯蚓粪样品10g加入90mL灭菌水中振荡20min，形成蚯蚓粪悬浮液，取1mL加入装有9mL灭菌水三角瓶中振荡形成10-2稀释，依次将蚯蚓粪样品稀释10-3、10-4、10-5、10-6、10-7。将培养基平板（PDA、NA）编号，然后用移液枪吸取10-4、10-5、10-6、10-7等一系列稀释菌液，取0.2mL依次接种在设定稀释度的NA平板上。10 材料与方法菌液用无菌的三角涂布棒在NA上涂匀，更换稀释度时都需在酒精灯上烧三角涂布棒灭菌。涂布好的NA静置20~30min，待菌液完全渗透到培养基内，把平板倒过来。26℃培养，2d后观察。从平板中挑取不同类型的单个菌落进行平板划线分离培养，培养2d。将划线长出的菌接种于已准备好的PDA固体培养基中，培养2d。2.1.2.2蚯蚓粪中拮抗细菌的复筛选取几种已知病害病原菌进行PDA平板培养5d~7d，备用。采用对峙培养方法，用直径9mm的无菌打孔器在生长完全的菌饼边缘打孔，每个PDA培养平皿中心放一个菌碟，离菌碟2.5cm处接细菌悬浮液的点，每个培养皿接上对称接上4个点，重复3次，不接细菌悬浮液为空白对照。26℃培养，4d后观察，记录菌落的生长状况，测菌落的直径。计算抑菌率的公式使用毛忠顺的方法。选择抑菌圈大的细菌进行保留。2.1.2.3细菌的保存短期保存：待保存的细菌在NA斜面培养基上28℃下培养48h，然后移到4℃冰箱中保存，2~3周转管一次。长期保存：1.5mL冻存管中加入1.2mL含有15%~20%灭菌甘油的NB培养液，挑单菌落于管中，置-80℃冰箱中保存。1~2年转管一次。2.1.2.4细菌发酵液的制备挑取纯培养的待测细菌培养物放入装有50mLNB培养液的100mL三角瓶中，将三角瓶置于恒温振荡培养箱中28℃180r/min震荡培养2d，并用无菌水配制成浓度为3×108cfu/mL的菌悬液备用。2.2拮抗细菌D2的抑菌谱测定2.2.1供试菌株准备2.2.1.1病原菌活化供试病原菌包括：黄瓜枯萎病菌（Fusariumoxysporumf．sp．cucumerinum）、大豆根腐病菌（FusariumorthocerasAppel.EtWollenweber）、水稻纹枯病菌（RhizoctoniasolaniKuhn）、黄瓜褐斑病菌（Corynesporacassiicola）和水稻稻瘟病菌（Pyriculariaoryzae），均由东北农业大学农学院植物病理学实验室提供。将病原菌接种在PDA中央，26℃培养7d，用灭菌的9mm打孔器在菌落边缘处打菌碟留用。2.2.1.2D2菌株活化把D2在NA上画线，28℃培养，24h有单菌落了留用。11 东北农业大学农学硕士学位论文2.2.2平板抑菌试验采用平板对峙法测定D2对病原菌的抑制效果。把病原菌菌碟放在9cmPDA中央，距离菌碟2.5cm的地方点D2悬浮液的点，每个培养皿对称点4个点，重复3次，不接D2的为空白对照。26℃培养7d，测对照菌落的直径，以及受到抑制的菌落直径，进行抑菌率的计算[76]。对照菌落生长直径-处理菌落生长直径抑菌率100%对照菌落生长直径2.3黄瓜枯萎病菌拮抗细菌D2的分类鉴定2.3.1主要试剂、药品及培养基2.3.1.1主要试剂和药品结晶紫染液：结晶紫2.0g溶解于20mL95%乙醇中，与1%草酸铵水溶液80mL混合，静止2d后过滤，储存在棕色瓶中用于细菌革兰氏染色；卢戈氏碘液：先将2.0g碘化钾加入少量蒸馏水（3~5mL），充分溶解，再加入1g碘，使其全部溶解，加水定容至300mL，用于细菌革兰氏染色和淀粉水解试验；番红复染液：2.5g番红加入100mL含量为95%的乙醇溶液中，充分溶解，取上述配好的番红乙醇溶液10mL与80mL蒸馏水混匀即成，用于细菌革兰氏染色；2.3.1.2培养基KingB培养基：蛋白胨20.0g，琼脂15.0g，MgSO4·7H2O1.5g，甘油10.0g，K2HPO41.5g，蒸馏水1000mL，pH7.0~7.2，分装试管，12l℃蒸汽灭菌20min。用于荧光产生试验。明胶培养基：牛肉膏蛋白胨培养基液1000mL，明胶120~180g，pH7.0~7.2，分装试管，培养基高度约5cm，12l℃蒸汽灭菌20min。用于明胶液化试验。淀粉培养基：蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，牛肉膏5.0g，可溶性淀粉2.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1000mL，pH7.2~7.4，12l℃蒸汽灭菌20min。用于淀粉水解试验。2.3.2主要仪器设备除2.1.1.5所提及的仪器外，还有微量加样器、PCR仪、水浴锅、DYY-6C型电泳仪等。2.3.3D2的形态特征观察拮抗菌株单菌落形态、革兰氏染色、芽孢染色均借助光学显微镜进行观察。使用扫描电镜观察拮抗抗菌株的形态和大小。12 材料与方法2.3.3.1单菌落形态利用逐级稀释法，将D2菌悬液用无菌水稀释，10-3到10-7依次涂在NA上，28℃培养2d，有了单菌落，观察菌落的形态。2.3.3.2革兰氏染色1.固定。2.结晶紫染1min。3.水冲洗。4.加碘液染3min。5.水洗，吸去水分。6.加95%酒精脱色，20s后水洗，吸去水分。7.番红染液染10s后，用水冲掉。8.油镜镜检。革兰氏阳性菌菌体被染成紫色，革兰氏阴性菌被染成红色[77]。2.3.3.3芽孢染色1.制备菌悬液。2.孔雀绿加热染色20min。3.涂片固定。4.水洗脱色。5.番前红复染3min。6.干燥,油镜镜检。芽孢呈绿色，芽孢囊及营养体呈红色[78]。2.3.3.4扫描电子显微镜观察利用扫描电子显微镜观察拮抗菌菌体形状，并测量菌体大小。2.3.4D2的生理生化鉴定参照车秀珠等（2001）[79]、方中达（1998）[80]、钱存柔等（2008）[78]的方法进行D2的生理生化特性测定。凡涉及用菌悬液接种的试验，都将菌悬液配成3×108cfu/mL。2.3.4.1荧光产生试验将D2接种在NA斜面上，28℃恒温培养2d，挑取培养物划线接种于KingB培养基斜面上，置28℃恒温培养2d后，在365nm紫外灯下观察有无荧光产生。把D2在NB里培养，不加菌是空白对照，依次放在4℃/41℃水浴锅里，培养2d，观察培养液，浑浊了是生长的。2.3.4.2耐盐性试验配制NaCl含量分别为2%，5%，7%，10%的NB培养液，接种D2，28℃150r/min振荡培养2~3d，观察细菌的生长情况[79]。2.3.4.3明胶液化试验取斜面培养的D2菌苔穿刺接种于明胶高层约2/3深度的培养基上，以未接种为空白对照。置于22℃（明胶低于20℃凝固成固体，高于24℃则自行呈液化状态）温箱中培养，3d、5d、7d分别观察明胶是否液化及液化程度。2.3.4.4淀粉水解试验将D2划线接种于可溶性淀粉平板上，28℃培养2~3d；打开皿盖，在平板上滴加少量碘液，轻轻旋转，使碘液覆盖整个平板。如果培养基变为深蓝色，说明拮抗菌未水解淀粉，为13 东北农业大学农学硕士学位论文阴性反应，以“－”表示；如果菌体周围出现无色透明圈，为阳性反应，以“＋”表示。2.3.5D2的分子生物学鉴定2.3.5.1D2基因组DNA的提取把D2接种在PDB中振荡培养，菌液浓度是1.8×108cfu/mL了，按照下列程序提取DNA：（1）取1mL菌液加入到1.5mL离心管中，7500r/min离心5min，弃上清；（2）细菌沉淀加入567μLTE重悬；（3）加30%SDS30μL，20mg/mL蛋白酶K3μL，37℃水浴1h；（4）加5mol/L的NaCl100μL，CTAB/NaCl80μL，65℃水浴10min；（5）加上述相同体积的氯仿:异戊醇（24:1），轻摇混匀，10000r/min离心5min，重复两次取水层；（6）加取得水层0.6倍体积的异丙醇，轻轻混合，10000r/min离心5min，弃上清；（7）加70%的乙醇洗涤1min，5000r/min离心1min，留沉淀；（8）把DNA溶在100μL去ddH2O里，-20℃留存待用。2.3.5.2D216SrDNA的PCR扩增及产物的序列测定（1）供试引物以基因组DNA为模板，采用细菌通用引物27F(5ˊ-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3ˊ)和1492R(5ˊ-GGTTACCTTGTTACGACTT-3ˊ)(引物由上海生工合成)进行PCR，扩增片段长度为1500bp左右。（2）16SrDNAPCR反应体系PCR反应体系见表2-1，PCR扩增程序见表2-2。表2-116SrDNAPCR反应体系Table2-116SrDNAPCRreactionsystem试剂体积（μL）Template(基因组DNA50ng/μL)0.527FPrimer1(10μM)0.51492RPrimer2(10μM)0.5Buffer(10×)(withMg2+)2.5dNTP(2.5mM)1Taq(1U/μL)0.2ddH2Oto2514 材料与方法表2-216SrDNAPCR扩增程序Table2-216SrDNAPCRamplificationprogram温度Temperature时间Time94℃预变性（Predenaturation）4min94℃变性（Denaturation）45s55℃退火（Annealing）45s72℃延伸（Elongation）1min循环次数（Cycle）30cycles72℃延伸（FinalElongation）10min4℃终止反应(hold)以上扩增条件是根据预试验结果优化组合得出的。（3）PCR产物的电泳检测与序列测定：PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，通过凝胶影像分析系统观察并拍照。将PCR产物送至上海生物工程技术公司测序，通过Internet网将所测序列与Genbank数据库中已报道的序列进行同源性比较。2.4D2发酵条件的优化2.4.1发酵液中D2的活菌数量与菌液吸光度的相关性将D2单菌落接种到NB培养液中，28℃，150r/min振荡培养2d。用无菌水稀释成10-4、-5、10-6、10-74个浓度。测定各浓度的OD10625。在NA上加进不同浓度菌悬液100μL，用三角涂布棒涂匀，28℃培养2d，计数不同浓度菌悬液培养出的菌落数，吸光值与菌体数量的相关性，3次重复。2.4.2D2种子液的制备及原始发酵条件D2种子液的制备同2.1.2.4。以下试验除特殊说明外，接种量均为摇瓶装液量的1%，28℃，150r/min振荡培养2d。2.4.3单因子试验2.4.3.1碳源种类对D2产量和抑菌活性的影响(1)单一碳源对D2产量和抑菌活性的影响以NB培养液为基础培养基，在培养液中分别加入0.5%的葡萄糖、可溶性淀粉、乳糖、麦芽糖、蔗糖、甘露醇作为碳源。以不加碳源作为空白对照，培养2d，测定培养后菌液的OD625值及其对黄瓜枯萎病菌的抑菌活性，确定D2生长的最适碳源。(2)碳源浓度对D2产量和抑菌活性的影响将最适碳源设0.1%，0.3%，0.5%，1.0%4个浓度，培养2d，测定培养后菌液的OD62515 东北农业大学农学硕士学位论文值及其对黄瓜枯萎病菌的抑菌活性，确定最适碳源浓度。2.4.3.2氮源种类对D2产量和抑菌活性的影响(1)单一有机氮源对D2产量和抑菌活性的影响在碳源含量不变的情况下，用牛肉膏、蛋白胨、酵母膏和胰蛋白胨分别代替原始发酵培养基中的牛肉膏和蛋白胨，用量为1.0%。以不加氮源作空白对照，培养2d，测定OD625值及其对黄瓜枯萎病菌的抑菌活性，每个处理重复3次，确定最适有机氮源。(2)单一无机氮源对D2产量和抑菌活性的影响在碳源含量不变的情况下，分别用KNO3、NH4Cl、NH4NO3和(NH4)2SO4代替原始发酵培养基中的牛肉膏和蛋白胨，用量为1.0%。以不加氮源作空白对照，培养2d，测定OD625值及其对黄瓜枯萎病菌的抑菌活性，每个处理重复3次，确定最适无机氮源。(3)初筛有机氮源不同浓度对D2产量和抑菌活性的影响对于已经初步选定的有机氮源，设0.5%、1.0%、1.5%和2.0%4个浓度，培养2d，测定OD625值及其对黄瓜枯萎病菌的抑菌活性，每个处理重复3次，确定最适有机氮源浓度。(4)初筛无机氮源浓度对D2产量和抑菌活性的影响较优碳源、有机氮源加入不同的无机氮源，0.1%、0.3%、0.5%和1.0%4个浓度，看其是否对D2的生长具有增效作用。以不加无机氮源的培养基作为对照，培养2d，测定OD625值及其对黄瓜枯萎病菌的抑菌活性，每个处理重复3次，确定无机氮源的最适浓度。2.4.3.3NaCl对D2产量和抑菌活性的影响将所筛选出的较优碳源、氮源中加入不同浓度的NaCl，设0.1%、0.3%、0.5%和1.0%四个浓度看其是否对D2的生长具有增效作用。以不加NaCl的培养基作为对照，培养2d，测定OD625值及其对黄瓜枯萎病菌的抑菌活性，每个处理重复3次，确定NaCl的最适浓度。2.4.4培养基优化正交试验在单因素试验结果的条件下，较优碳源（0.3%、0.5%和1.0%）、较优有机氮源（1.0%、1.5%和2.0%）、较优无机氮源（0.1%、0.3%和0.5%）、NaCl（0.1%、0.3%和0.5%）。通过3种浓度进行4因素3水平正交优化试验，测定OD625值还有它对黄瓜枯萎病菌的抑菌活性。表2-3L4)正交设计因素表9(3Tab.2-3L4)Factorsandlevelsoftheorthogonaltest9(3水平酵母膏(%)NaCl(%)蔗糖(%)NH4NO3(%)LevelYeastextractSodiumchlorideSucroseAmmoniumnitrate11.00.10.30.121.50.30.50.332.00.51.00.516 材料与方法表2-4L49(3)正交试验设计表Tab.2-4L4)Orthogonaltest9(3处理号酵母膏(%)NaCl(%)蔗糖(%)NH4NO3(%)No.YeastextractSodiumchlorideSucroseAmmoniumnitrate11.00.10.30.121.00.30.50.331.00.51.00.541.50.31.00.151.50.50.30.361.50.10.50.572.00.50.50.182.00.11.00.392.00.30.30.52.4.5培养条件的优化试验2.4.5.1温度对D2产量和抑菌活性的影响采用优化后的NB发酵培养液，定量接种后分别在25℃、28℃、30℃、33℃和37℃条件下培养2d，测定培养后菌液的OD625值及其对黄瓜枯萎病菌的抑菌活性，每个处理重复3次，确定最适温度。2.4.5.2pH值对D2产量和抑菌活性的影响调节优化后发酵培养液的初始pH值分别为4.0、5.0、6.0、6.5、7.0和7.5，培养2d，测定培养后菌液的OD625值及其对黄瓜枯萎病菌的抑菌活性，每个处理重复3次，确定最适pH值。2.4.5.3接种量对D2产量和抑菌活性的影响将D2的种子液接种量为100mL摇瓶装液250μL、500μL、1000μL、1500μL、2000μL和2500μL，培养2d，测定培养后菌液的OD625值及其对黄瓜枯萎病菌的抑菌活性，每个处理重复3次，确定最适接种量。2.4.5.4装液量对D2产量和抑菌活性的影响在100mL三角瓶中装液量分别为10mL、20mL、30mL、40mL、50mL和60mL，培养2d，测定培养后菌液的OD625值及其对黄瓜枯萎病菌的抑菌活性，每个处理重复3次，确定最适装液量。17 东北农业大学农学硕士学位论文2.5D2抑菌机制于培养皿边缘挑取纯培养的黄瓜枯萎病菌菌丝以及受拮抗菌D2生长抑制后靠近D2的黄瓜枯萎病菌菌丝于载玻片上，盖上盖玻片，用普通光学显微镜在40×放大下进行观察，探究D2抑菌机制。2.6D2对黄瓜种子发芽的影响黄瓜种子进行消毒处理，26℃催芽24h。D2在NB中摇瓶培养，28℃培养48h，配制菌悬液（108cfu·mL-1）。把种子在菌悬液里泡上30min，放在培养皿里，摆在灭菌后的滤纸上面，26℃培养48h，测胚芽、胚根的长度，算出发芽率。无菌水浸泡种子作空白对照。每处理10粒，3次重复[81]。2.7黄瓜枯萎病的盆栽防效2.7.1拮抗菌发酵液对黄瓜枯萎病的治疗作用本试验于2014年6~7月在东北农业大学园艺站进行。把病原菌在PDB中摇瓶培养，28℃、170r·min-18d，无菌水稀释，制成107孢子·L-1的孢子悬浮液。D2接入NB培养4d，用无菌水稀释成3个稀释度的菌体悬浮液，50倍、100倍和150倍。3%次氯酸钠消毒种子15min，清水冲洗，放在培养皿中的滤纸上，28℃恒温培养箱中催芽。将消毒、催芽后的黄瓜种子播种在装有无菌土和蛭石以2:1的比例混合的塑料钵中，子叶展平后灌根接种枯萎菌孢子悬浮液50mL，24h后接种D2悬浮液50mL，分别设置3个稀释浓度，50倍、100倍和150倍，多菌灵作为化学药剂对照，稀释1000倍，每钵50mL；以清水50mL为空白对照。每处理10钵，3次重复。接种10d后开始观察幼苗发病情况[82]。2.7.2拮抗菌发酵液对黄瓜枯萎病的预防作用黄瓜种子催芽，播种。2片真叶期时接种。先用灌根接种法，接入拮抗菌发酵液每钵50ml，分别设置3个稀释浓度，50倍、100倍和150倍。24h后接入107孢子·L-1的枯萎菌孢子悬浮液，每钵50mL；多菌灵作为化学药剂对照，稀释1000倍，每钵50mL；清水作为空白对照。每个处理10钵，3次重复。10d后调查各处理防效。2.7.3调查方法苗期调查按病情分级标准，计算病情指数和防效。病级的分级标准为0:无病症；1:胚轴或子叶出现轻微病症，但生长正常；2:胚轴或子叶出现明显坏死斑，或一片子叶黄化，影响生长；3:两片子叶黄化，或一片子叶枯死；4:18 材料与方法两片子叶生长僵化，植株部分萎蔫或停止生长；5:整株萎蔫、倒伏或枯死。（各级病叶数相对级数值）病情指数100调查总叶数5空白对照病情指数-处理区病情指数防治效果%100空白对照病情指数19 东北农业大学农学硕士学位论文3结果与分析3.1黄瓜枯萎病菌拮抗细菌的筛选本试验采用稀释平板法，分别从先后获得的两批新鲜蚯蚓粪中分离到374株细菌，编号为D1~D374。对这374株细菌进行枯萎病菌拮抗性试验，共28株细菌对黄瓜枯萎病菌具有一定的拮抗作用（表3-1）。其中以D2的抑菌效果最好，抑菌直径达28.28mm，并且经多次重复试验，抑菌效果稳定（图3-1）。表3-1黄瓜枯萎病拮抗细菌的筛选Tab.3-1ThescreeningofantagonisticbacteriatoFusariumoxysporumf．sp．cucumerinum菌株编号抑菌直径（mm）菌株编号抑菌直径（mm）No.ofstrainInhibitingdiameterNo.ofstrainInhibitingdiameterD129.16D12334.66D228.28D12939.08D1830.68D13637.52D2232.74D18035.38D2432.90D20935.06D2634.82D21831.38D4134.66D24332.94D4437.04D26534.74D5431.82D27236.28D6935.48D29735.76D8835.06D31233.44D9136.12D32231.80D9333.40D34938.42D11437.84D35537.6220 结果与分析A：D2对黄瓜枯萎病菌的抑菌效果；B：对照A:EffectofD2againstFusariumoxysporumf．sp．cucumerinum；B:CK图3-1菌株D2对黄瓜枯萎病菌的拮抗效果Fig.3-1EffectofD2againstFusariumoxysporumf．sp．cucumerinum3.2拮抗细菌D2的抑菌谱测定对拮抗菌株D2进行抑菌谱测定（图3-2，表3-2），黄瓜枯萎病菌（A）抑菌率为64.0%、水稻稻瘟病菌（B）抑菌率为58.1%、水稻纹枯病菌（C）抑菌率为62.9%、黄瓜靶斑病菌（D）抑菌率为70.7%、大豆根腐病菌（E）抑菌率为62.5%，结果表明菌株D2对这5种病原菌均有拮抗作用，其中黄瓜枯萎病菌（A）、水稻纹枯病菌（C）和黄瓜靶斑病菌（D）效果较好。图3-2菌株D2对不同病原菌的拮抗效果Fig.3-2EffectofD2againstdifferentpathogens21 东北农业大学农学硕士学位论文表3-2D2菌株体外诱导对5个测试病原菌的生长抑制直径Tab.3-2D2strain-inducedgrowthinhibitiondiameteragainst5testpathogensinvitro病原菌抑菌直径抑菌率(%)病原菌抑菌直径抑菌率(%)Pathogen（mm）InhibitionPathogen（mm）InhibitionInhibitionrateInhibitionratediameterdiameterA32.4364.0B37.7158.1C33.3962.9D18.8070.7E33.7562.53.3黄瓜枯萎病菌拮抗细菌D2的分类鉴定3.3.1D2的形态特征观察D2在NA培养基上生长良好，单菌落形态为圆形或近圆形，扁平状，中等大小，表面光滑，不透明（图3-3A）。革兰氏染色为阴性（图3-3B），不产生芽孢。扫描电子显微镜下菌体呈直杆状，单极生鞭毛，（0.5~1.0）um×（1.5~4.0）um（图3-4）。图3-3菌落特征及革兰氏染色Fig.3-3ThemorphologyandgramstainofD2图3-4拮抗细菌D2的电镜观察（20000×）Fig.3-4D2underscanningelectronmicroscope22 结果与分析3.3.2D2的生理生化特性鉴定拮抗细菌D2的生理生化特性见表3-3。实验结果表明，拮抗细菌D2在荧光反应实验中结果为阴性，即不产生荧光。D2在4℃时不生长，在41℃时可以生长。在耐盐性实验中，D2在NaCl浓度为2%和5%时可以生长，7%和10%时不生长。明胶液化实验中，D2可以使明胶液化。淀粉水解实验中，D2不可以分解淀粉。根据《常见细菌系统鉴定手册》及《伯杰氏细菌鉴定手册》[83]综合分析菌株D2形态特征及生理生化特性，初步鉴定菌株D2属于伯克霍尔德氏菌属（Burkholderia）。表3-3D2的生理生化特性Tab.3-3MainphysiologicalandbiochemicalcharacteristicsofD2细菌学试验鉴定结果BacteriologicaltestsIdentificationresults荧光反应（Fluorescencereaction）－生长试验4℃（Growthat4℃）－41℃（Growthat41℃）＋2%（2%NaCltolerance）＋耐盐性试验5%（5%NaCltolerance）＋7%（7%NaCltolerance）－10%（10%NaCltolerance）－明胶液化（Gelatinliquefaction）＋淀粉水解试验（Starchhydrolysistest）－注：“＋”阳性，“－”阴性。Note:“+”meanspositivebiochemicalreaction,“－”meansnegativebiochemicalreaction.3.3.3D2的分子生物学鉴定3.3.3.1D2基因组DNA的提取移液枪吸取DNA样品4μL，在1%琼脂糖凝胶中电泳。所得DNA片段集中，表明DNA的质量较好，可以用于下一步的PCR操作，进行目的片段的扩增。3.3.3.2D2的16SrDNA鉴定利用细菌16SrDNA通用引物27F和1492R对拮抗细菌D2的基因组DNA进行PCR，扩增后用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果见图3-5，从D2基因组DNA中成功扩增出与预期大小一致的特异性片段，表明扩增片段即为目的片段，大小为1462bp。23 东北农业大学农学硕士学位论文图3-5D216SrDNA的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图谱Fig.3-5AgarosegelelectrophoresisforPCRproductsof16SrDNAofD2将PCR产物送至上海生工测序，测序结果如下：GCATGTCTTACACATGCAAGTCGAACGGCAGCACGGGTGCTTGCACCTGGTGGCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATACATCGGAACATGTCCTGTAGTGGGGGATAGCCCGGCGAAAGCCGGATTAATACCGCATACGATCCATGGATGAAAGCGGGGGACCTTCGGGCCTCGCGCTATAGGGTTGGCCGATGGCTGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCAGTAGCTGGTCTGAGAGGACGACCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTTGTCCGGAAAGAAATCCTTGGCTCTAATACAGCCGGGGGATGACGGTACCGGAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTTTGCTAAGACCGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTGGTGACTGGCAGGCTAGAGTATGGCAGAGGGGGGTAGAATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCCCCTGGGCCAATACTGACGCTCATGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAACTAGTTGTTGGGGATTCATTTCCTTAGTAACGTAGCTAACGCGTGAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGATGATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCTACCCTTGACATGGTCGGAATCCTGCTGAGAGGCGGGAGTGCTCGAAAGAGAACCGGCGCACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTGCTACGCAAGAGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTATGGGTAGGGCTTCACACGTCATACAATGGTCGGAACAGAGGGTTGCCAACCCGCGAGGGGGAGCTAATCCCAGAAAACCGATCGTAGTCCGGATTGCACTCTGCAACTCGAGTGCATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACA24 结果与分析CCATGGGAGTGGGTTTTACCAGAAGTGGCTAGTCTAACCGCAAGGAGGACGGTCACCACGGTAGGATTCATGACTGGGGGAAGTCGAACAAGAGGCCTTAGG登录Genbank数据库，将测序结果与Genbank中已报道的序列进行同源性比较，结果如图3-6至3-8。图3-6D2基因BLAST比对Fig.3-6TheBLASTtestofD2图3-7D2与相关菌株16SrDNA序列的相似性Fig.3-7Similarityof16SrDNAsequenceofD2strainandsimilarstrains图3-8D2与NR_074686.1的同源序列比对Fig.3-8ThesamegenesequenceD2andNR_074686.1如图3-7，结果表明D2与NR_074686.1（BurkholderiacenocepaciaAU1054strainAU1054）、CP001025.1（BurkholderiaambifariaMC40-6）、CP000958.1（BurkholderiacenocepaciaMC0-3）、CP000458.1（BurkholderiacenocepaciaHI2424）和CP000378.1(BurkholderiacenocepaciaAU1054)的同源性均达到99%，证明该菌株为洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderiacenocepacia）。25 东北农业大学农学硕士学位论文3.4D2发酵条件的优化3.4.1发酵液中D2的菌体数量与发酵液吸光度的相关性如图3-9所示，发酵液中D2的菌体数量对数值与发酵液OD625值有较强的相关性，二者呈线性关系。因此可以用发酵液的OD625值考量发酵液中的D2数量。以下试验均用发酵液的OD625值来考量发酵液中的D2数量。9.59.0y=1.904x+6.131）8.5R²=0.9888.07.5logcfu/ml7.0Population6.5菌量（6.05.50.00.20.40.60.81.01.21.41.6OD625值OD625value图3-9发酵液中的菌体数量与发酵液吸光度的相关性Fig.3-9Correlationbetweenthallusquantityinfermentationborthandabsorbancevalue3.4.2培养基成分对D2产量和抑菌活性的影响3.4.2.1碳源种类对D2产量和抑菌活性的影响（1）单一碳源对D2产量和抑菌活性的影响单一碳源筛选试验结果如图3-10所示，供试的碳源均可被D2利用。其中，以蔗糖作为碳源时抑菌率最高，达69.41%，且菌体产量仅次于甘露醇，OD625值为1.880，经济方面考虑，蔗糖较为低廉，因此选定蔗糖糖作为最适碳源进行下一步单一碳源浓度试验。图3-10单一碳源对D2产量和抑菌活性的影响Fig.3-10EffectofsinglecarbonhydratesourcesonpopulationandantibacterialactivityofD2（2）单一碳源浓度对D2产量和抑菌活性的影响实验结果表明，抑菌率随着蔗糖浓度的变化波动较小，当蔗糖浓度为0.3%时，抑菌率26 结果与分析最高，达69.85%，OD625值为1.074，仅次于浓度为0.5%时的OD625值，因此选择蔗糖糖0.3%浓度作为最适浓度（图3-11）。图3-11蔗糖糖浓度对D2产量和抑菌活性的影响Fig.3-11EffectofsucroseconcentrationonpopulationandantibacterialactivityofD23.4.2.2氮源种类对D2产量和抑菌活性的影响（1）单一有机氮源对D2产量和抑菌活性的影响试验结果如图3-12所示，供试的4种有机氮源中，虽然牛肉膏使D2产量最高，抑菌率也最高，但是出于经济等考虑，选择抑菌率、产量仅此于牛肉膏的酵母膏，酵母膏OD625值为1.504，抑菌率为68.9%，价格更低廉的酵母膏为有机氮源较为合适，适合大规模发酵。图3-12单一有机氮源对D2产量和抑菌活性的影响Fig.3-12EffectofsingleorganicnitrogensourcesonpopulationandantibacterialactivityofD2（2）酵母膏浓度对D2产量和抑菌活性的影响试验结果表明，在酵母膏浓度为1.5%时D2的抑菌率最高，为80.77%，且产量较大，OD625值为2.116，因此酵母膏浓度选择1.5%（图3-13）。27 东北农业大学农学硕士学位论文图3-13酵母膏浓度对D2产量和抑菌活性的影响Fig.3-13EffectofyeastextractconcentrationonpopulationandantibacterialactivityofD2（4）单一无机氮源对D2产量和抑菌活性的影响试验结果（图3-14）表明，无机氮源对D2生长有一定的促进作用。在供试的4种无机氮源中，以NH4NO3作为无机氮源时D2产量最高，OD625值是1.956，且抑菌率显著高于其它无机氮源，达75.47%，因此单一无机氮源选择NH4NO3。KNO3NH4ClNH4NO3(NH4)2SO4CK图3-14单一无机氮源对D2产量和抑菌活性的影响Fig.3-14EffectofsingleinorganicnitrogensourcesonpopulationandantibacterialactivityofD23.4.2.3NaCl和NH4NO3浓度对D2产量和抑菌活性的影响(1)NaCl浓度对D2产量和抑菌活性的影响试验结果（图3-15）表明，一定量的NaCl能促进D2生长，亦能提高D2的抑菌活性，其中以0.3%的NaCl效果最好，其抑菌率最高，达80.6%，OD625值是2.033。图3-15NaCl对D2产量和抑菌活性的影响Fig.3-15EffectofsodiumchlorideonpopulationandantibacterialactivityofD228 结果与分析(2)NH4NO3浓度对D2产量和抑菌活性的影响试验结果（图3-16）表明，一定量的NH4NO3能促进D2生长，亦能提高D2的抑菌活性，其中以0.5%的NH4NO3效果最好，抑菌率达81.31%，OD625值是1.989。图3-16NH4NO3浓度对D2产量和抑菌活性的影响Fig.3-16EffectofAmmoniumnitrateconcentrationonpopulationandantibacterialactivityofD23.4.2.4培养基优化正交试验依据单因素试验结果，进行酵母膏、蔗糖、NaCl和NH4NO3四因素三种不同浓度的正交试验。结果见表3-4，K1、K2、K3分别表示在各因素各水平下抑菌带宽度的总和，K1、K2、K3分别表示在各因素各水平下抑菌带宽度的平均值。R为同一因素各水平平均值的极差(极差=平均值的最大值-平均值的最小值)，R可以反映单因素不同水平的变动对抑菌带宽度的影响程度。R越大表示影响越大，反之越小。由表3-3得出因素的主次顺序依次为蔗糖、酵母膏、NaCl、NH4NO3。主要因素取最好水平，次要因素统筹考虑选取适当的水平。由此得出D2的实验室发酵配方为：酵母膏1.5%，NH4NO30.5%，蔗糖0.3%，NaCl0.3%。按此条件的试验在正交表的9次试验中并没有出现，通过做补充试验，结果得到抑菌直径达到20.36mm，大于正交试验结果中的最高值18.81mm（图3-17、3-18），说明利用正交试验优化培养基的试验是成功的。29 东北农业大学农学硕士学位论文表3-4培养基优化正交试验Tab.3-4OrthogonaltestofculturemediumoptimizationNaCl(%)NH4NO3(%)处理号酵母膏(%)蔗糖(%)抑菌直径(mm)SodiumAmmoniumNo.YeastextractSucroseInhibitingdiameterchloridenitrate11.00.10.30.119.7321.00.30.50.318.8131.00.51.00.520.1341.50.31.00.121.0751.50.50.30.319.4261.50.10.50.519.5472.00.50.50.119.3882.00.11.00.320.4692.00.30.30.520.59K158.6759.7359.7460.18--K260.0360.6457.7358.69--K360.4358.9361.6660.26--K119.5619.9119.9120.06--K220.0120.2119.2419.56--K320.1419.6420.5520.09--R0.580.571.310.53--图3-17培养基优化前D2的抑菌效果图3-18培养基优化后D2的抑菌效果Fig.3-17AntibacterialeffectofD2Fig.3-18AntibacterialeffectofD2afterbeforemediumoptimizationmediumoptimization3.4.3培养条件的优化试验3.3.3.1温度对D2产量和抑菌活性的影响30 结果与分析采用优化后的NB发酵培养液，定量接种后分别在25℃、28℃、30℃、33℃和37℃条件下培养48h。抑菌试验结果如图3-19，表明在所选择的温度范围内，30℃时D2的生长量最大，OD625值是2.238，抑菌率最高，达82.67%，因此将此温度作为D2生长的最适温度。图3-19温度对D2产量和抑菌活性的影响Fig.3-19EffectofculturaltemperatureonpopulationandantibacterialactivityofD23.4.3.2pH值对D2产量和抑菌活性的影响优化后发酵培养液的初始pH值分别调为4.0、5.0、6.0、6.5、7.0和7.5。由于pH为7.0和7.5时，菌液OD625值相当小，分别为0.055和0.048，培养液较清澈，因此没有进行这两个pH值的皿内抑菌试验，抑菌试验结果表明，D2生长且抑菌活性最强的pH值为6.0，OD625值是1.814，抑菌率为80.74%（图3-20）。图3-20pH值对D2产量和抑菌活性的影响Fig.3-20EffectofpHonpopulationandantibacterialactivityofD23.4.3.3接种量对D2产量和抑菌活性的影响接种量分别为250μL、500μL、1000μL、1500μL、2000μL和2500μL，不同接种量试验结果（图3-21）表明，接种量在1000μL时D2产量最大，OD625值是2.344，发酵液的抑菌活性也最高，达84.09%，因此，选择1000μL为最佳接种量。31 东北农业大学农学硕士学位论文图3-21接种量对D2产量和抑菌活性的影响Fig.3-21EffectofinoculationvolumesonpopulationandantibacterialactivityofD23.4.3.4装液量对D2产量和抑菌活性的影响装液量分别为10mL、20mL、30mL、40mL、50mL和60mL，试验结果（图3-22）表明，D2发酵液的菌量随着装液量的增加而升高，而抑菌率只有在装液量为40mL时最大，因此选择40mL为装液量。图3-24装液量对D2产量和抑菌活性的影响Fig.3-22EffectofmediumvolumesonpopulationandantibacterialactivityofD23.5D2抑菌机制普通光学显微镜40×放大下可观察到（图3-23）A中纯培养的黄瓜枯萎病菌，菌丝浓密，孢子量多，而B中经D2抑制后的黄瓜枯萎病菌，菌丝量少，经移动视野范围，看不到孢子的存在，并没发现菌丝有其它异常，如膨大等，由此可知，D2的抑菌机制为抑制病原菌孢子的萌发和菌丝的生长。32 结果与分析图3-23D2在光学显微镜下抑菌前后对照Fig.3-23D2inopticalmicroscopebeforeandafterantimicrobialcontrol3.6D2对黄瓜种子发芽的影响经过菌株D2菌悬液浸泡处理的黄瓜种子（图3-24B）的胚芽、胚根的长度明显长于空白对照（图3-24A）即未经菌株D2菌悬液浸泡处理的黄瓜种子。经过D2菌株处理的黄瓜种子胚芽平均长度为15.31mm，胚根平均长度为15.05mm；空白对照的黄瓜种子胚芽平均长度为14.82mm，胚根平均长度为11.65mm。种子发芽率均为100%。由表3-5可以看出，D2菌株对黄瓜种子萌发没有负面影响，而且具有促生作用。经D2处理的种子发芽率、胚芽长度与对照差异不大，但胚根长度明显大于对照。因此可以在黄瓜种子催芽时对其预先进行D2菌悬液浸泡处理，起到对胚根的促生作用。图3-24菌株D2对黄瓜种子的促生作用Fig.3-24EffectofgrowthpromotingoncucumberseedsofstrainD233 东北农业大学农学硕士学位论文表3-5D2菌株对黄瓜种子发芽的影响Tab.3-5EffectofD2strainonthegerminationofcucumberseeds处理种子发芽率(%)胚芽长度(mm)胚根长度(mm)TreatmentsGerminationratePlumulelengthRadiclelengthCK10014.811.6D2strain10015.315.03.7黄瓜枯萎病的盆栽防效3.7.1拮抗菌发酵液对黄瓜枯萎病的治疗效果D2发酵液优化条件下的对黄瓜治疗试验结果见表3-6，D2发酵液稀释50倍时，防效达70.48%，稀释100倍时，防效达69.89%，稀释150倍时，防效达69.58%，多菌灵防效达78.09%，D2稀释50倍防效仅次于多菌灵的防效，证明D2对黄瓜枯萎病具有良好的治疗效果，有进一步研发价值。病情分级标准如图3-25。并且拮抗菌D2的加入对黄瓜幼苗的生长具有促进作用如图3-26，接了拮抗菌的幼苗同一时间已经长出真叶，而对照组均无真叶长出。表3-6D2发酵液对黄瓜枯萎病的治疗防效Tab.3-6ThetreatmenteffectofD2fermentationliquidagainstcucumberfusariumwiltdisease处理平均病情指数防治效果(%)TreatmentsAverageofdiseaseindexRelativecontroleffectD250倍稀释13.3370.48±1.28bD2100倍稀释13.6769.89±0.87bD2150倍稀释14.2569.58±0.86b多菌灵10.0578.09±0.47aCK56.00--注：小写字母表示P=0.05水平下的差异显著性。Note：SmallletterindicatesthesignificanceofdifferenceatP=0.05level.34 结果与分析0级1级2级3级4级5级从左到右分别是：0级到5级Fromlefttorightare:level0tolevel5图3-25拮抗菌对黄瓜枯萎病防治病情分级图示Fig.3-25Antagonisticbacteriaontheclassificationschemaofpreventionandcontrolcucumberfusariumwiltdisease图3-26D2对黄瓜幼苗的促生作用Fig.3-26EffectofD2oncucumberseedlingsgrowthpromoting注：A:对照,B:已加拮抗菌Note:A:control,B:withantagonisticbacteria3.7.2拮抗菌发酵液对黄瓜枯萎病的预防效果D2发酵液对黄瓜枯萎病防治试验结果如表3-7所示，D2发酵液稀释50倍时，防治效果达到77.82%，稀释100倍时，防治效果为77.56%，稀释150倍时，防治效果达到76.52%，多菌灵防效70.59%，D2发酵液防效高于多菌灵的防效。证明D2对黄瓜枯萎病有良好的预防效果。35 东北农业大学农学硕士学位论文表3-7D2发酵液对黄瓜枯萎病的预防效果Tab.3-7ThepreventionofthefermentationbrothofD2onfusariumwiltofcucumber处理平均病情指数防治效果(%)TreatmentsAverageofdiseaseindexRelativecontroleffectD250倍稀释10.2677.82±1.18aD2100倍稀释10.5977.56±0.56aD2150倍稀释11.5276.52±0.77a多菌灵13.4670.59±0.72bCK56.00--注：CK为清水空白对照；多菌灵防效。小写字母表示P=0.05水平下的差异显著性。Note:CKmeanswater;ThecontroleffectofchemicalfungicideCarbendazim.SmallletterindicatesthesignificanceofdifferenceatP=0.05level.36 讨论4讨论4.1蚯蚓粪中筛选生防细菌用于防治土传病害的潜力在植物病害普遍发生的蔬菜栽培区，开发拮抗微生物进行防治，在某种程度上能降低化学农药的使用，减少农药残留。化学药剂对植物病害的防效纵然非常高，但是因为长时间超剂量使用同种农药及使用不恰当，不仅病原菌产生抗药性、常用药剂防效变低，还导致环境污染。所以，需要提倡并大力宣传生物防治，筛选出可以有效防治植物病害的生物材料[84]。在本实验中从经过蚯蚓粪处理的废弃物中分离出拮抗细菌，经过培养基以及发酵条件的初步优化得到的发酵液用于防治黄瓜病害。试验结果显示，拮抗细菌对于黄瓜枯萎病有一定的防治效果。拮抗菌株用来防治植物病害在实际使用里会受到各种要素的影响，环境要素的变化能影响到拮抗物质抑菌活性的发挥。尤其对于一些活菌制剂以致影响到有效微生物在植物和土壤里的定殖。所以在拮抗细菌的施用里，选择恰当的浓度、时间、方式都非常重要，这涉及到在大田里实际施用时的防治效果的稳定性。本文通过对分离得到的374株细菌进行发酵液的抑菌活性测定，筛选出对黄瓜枯萎病菌有一定抑菌效果的菌株28个。为减小工作量以便对高防效菌株做深入研究，对28株菌株进行单胞分离、抑菌活性测定，确定D2为最佳菌株，选作下一步研究的实验材料。对原始拮抗菌株进行单胞分离纯化之后，抑菌活性显著加强。通过对培养基与发酵培养条件优化后，拮抗菌株的产量与抑菌的效果得到了提升。实验结果显示，此拮抗细菌用来防治黄瓜枯萎病的潜力是非常大的，是选作生物防治的有用途径之一，选用生防细菌来防治植物病害可以成为可能，但是它更好地应用途径与利用方法需要更深入的研究。蚯蚓粪价格低廉，它里面含有种类丰富的微生物，在植物病害生物防治中作用显著，今后能用在其它类别植物病菌拮抗菌的筛选。4.2关于拮抗细菌的分离和筛选近几年来，全世界广泛利用有益微生物和它的代谢产物来抑制病原菌的生存与活动，让这一防治战略发展迅猛，这中间拮抗细菌在植物病害防治中起到了至关重要的作用，这也说明了微生物之间的互作与互相对抗的结果。任何病原物甚至生物体全部存在它们的天敌，说明利用拮抗细菌进行黄瓜枯萎病的生物防治是非常有潜力与希望的。在拮抗菌的筛选方式里，经常使用的方式主要是平板划线法、抑菌圈法或者琼脂块法及纸片法等[85]。此试验里病原菌是真菌，所筛选的拮抗菌为细菌，因此，经改良使用了对峙法，把病原菌经培养后取菌饼接在平板中央，拮抗细菌配制成菌悬液，在病原菌菌饼周围蘸取拮抗细菌菌液对称点4个菌液点，然后进行培养，这种方法观察结果时更加直观、快速。当前，生防细菌的筛选依旧采用上面所讲到的传统方式，它的测定结果在很多条件下依旧当做一个重要的指标，它的优点是直观、方便、速度快。但是研究人员发现，细菌在离体37 东北农业大学农学硕士学位论文条件下的拮抗作用和自然环境中的防病效果通常没有必然的关系，某些具备优良生防效果的菌株，在平皿试验时，对病原菌表现出了很弱的拮抗作用甚至无拮抗作用。这就说明判断本文中分离出的374株细菌对黄瓜枯萎病的拮抗作用仅仅用平皿抑制这一种指标，可能会丢失一些大田生防效果好的菌株。所以，急需研究一种新的分离、筛选方法，减少优良菌株的损失率。4.3关于拮抗菌株的鉴定本实验目的在于筛选出拮抗效果较好的优良拮抗菌株，如果想要将一个菌株在实际生产中推广应用，尤其作为商品化产品注册时，菌株的鉴定必不可少。本文在菌株的形态、培养性状、生理生化的特性等传统鉴定方法的基础上，结合16SrDNA分子鉴定方法对D2菌株分类地位进行鉴定。传统鉴定结果与《常见细菌系统鉴定手册》及《伯杰细菌鉴定手册》描述的洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderiacenocepacia）特征完全一致。16SrDNA序列分析进行细菌鉴定是国际上通用的鉴定技术，一般认为16SrDNA序列同源性小于98%，可以认为种不同，同源性小于93%~95%，可以认为属不同[79]。D2与洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderiacenocepacia）NR_074686.1、CP001025.1、CP000958.1、CP000458.1和CP000378.1的匹配率均达到99%，认为菌株D2即为洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderiacenocepacia）。伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)的一些细菌具备生物防治、促进植物生长发育与生物修复等作用。伯克霍尔德菌可以产生很多种具备抗菌活性的代谢产物像铁载体、吩嗪、硝吡咯菌素、苯基吡咯、单萜生物碱等。现在已经应用在生物防治，分解有毒物质等领域。4.4关于拮抗菌株发酵条件的优化细菌的生长发育与繁殖依托于从周围环境里吸收营养物质，所以培养基里各种成分和它的比例会在某种程度上影响次生代谢产物的产量[86]。培养基的配方不只影响次生代谢产物的产量，它的比例还影响着次生代谢产物的类别[87]。此外，培养条件对菌株代谢活性的影响同样很大，这里面培养温度的高低还有接种量的大小最重要[88]。发酵时间的恰当与否直接影响目标活性物质的含量和品质。所以，通过具体的实验步骤，确定最佳培养基配方还有适宜的发酵条件，可以在极大程度上改善抑菌活性物质的质量并且提高产量，与此同时，还能够大大降低成本。本试验采用的培养条件是在参考前人研究结果的基础上，作了部分调整，得到最佳培养基配方和发酵条件。所用的菌株是从新鲜蚯蚓粪中分离的原始菌株，未进行其它处理。38 结论5结论（1）从374株细菌中筛选出对黄瓜枯萎病菌有拮抗活性的菌株28个，其中以菌株D2抑菌效果最好，抑菌直径达28.28mm，抑菌效果稳定。（2）D2单菌落形态为圆形或近圆形，扁平状，中等大小，表面光滑，不透明。革兰氏染色为阴性。菌体杆状，不产生芽孢。扫描电子显微镜下菌体呈直杆状，（0.5~1.0）um×（1.5~4.0）um。在4℃不生长，41℃可以生长。D2在NaCl浓度小于5%时可生长，大于7%时不生长。D2不产生荧光，可使明胶液化，可分解淀粉。D2的分子生物学鉴定中，得到目的片段大小为1462bp，将PCR产物测序，测序结果与Genbank中已报道的序列进行同源性比较，证明该菌株为洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderiacenocepacia）。（3）拮抗菌株D2的实验室发酵配方为：酵母膏1%，蔗糖0.5%，NaCl0.3%，NH4NO30.3%；最佳培养条件：发酵温度30℃，培养基pH6.0，接种量2.0%，装液量为100mL三角瓶中装液40mL。（4）D2发酵液优化条件下的对黄瓜治疗试验，D2稀释50倍时防效达70.48%，稀释100倍时防效达69.89%，稀释150倍时防效达69.58%，多菌灵防效达78.09%，D2稀释50倍防效仅次于多菌灵的防效。D2发酵液对黄瓜枯萎病预防试验，D2发酵液稀释50倍时，防治效果达到77.82%，稀释100倍时，防治效果为77.56%，稀释150倍时，防治效果为76.52%，多菌灵防效达70.59%，D2发酵液稀释50倍时防效比多菌灵的防效多7.23个百分点。39 东北农业大学农学硕士学位论文致谢本论文是在导师张艳菊教授的悉心指导下完成的。非常感谢老师选定了这样一个好的题目。导师治学态度严谨、正直谦和的品格值得我终生学习。另外，在三年的研究生学习期间，老师从生活、学习方面给予了我热情的关怀和帮助。在此表示诚挚的感谢。本试验得到了植物病理教研室全体老师的大力支持，在这里表示由衷的感谢。特别感谢文景芝老师、张俊华老师、张铉哲老师、李永刚老师、杨明秀老师以及刘大伟老师的指导和帮助。在这三年的学习和试验完成的过程中，还得到了许多同学、师弟、师妹的帮助，特别要感谢师姐刘东、代丽婷、苗笛，师兄杨洪生、王文博、马柏壮，师妹刘丽、刘欣欣、祝海娟、党悦嘉、赵珊、张晓慧、白玲玲，师弟刘奇、柴洪庆、高继洋，刘烨、郝璐、李薇、侯思雨、所冰、耿肖兵、鲁健聪等同学为试验提供的宝贵意见和在生活中的帮助，是你们无私的关心和帮助使我的试验得以顺利地完成。感谢我的父母、家人长时间以来给我的支持和鼓励。最后，再一次感谢帮助过我的老师、朋友、同学和家人，祝你们身体健康，一生平安！40 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