电子转运黄素蛋白β减轻糖尿病肾病肾小管上皮细胞凋亡的作用及机制研究

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1、？？京碱和皆聲化中画刮《版博±研究生学位论文臟北京协和医学院研究生院学校代码：１００２３学号：Ｂ２（Ｈ２０２３００２博±学位论文电子转运黄素蛋白Ｐ减轻糖尿病肾病肾小管上皮细胞调亡的作用及机制研究所院：中日友巧医院临床医学研巧所姓名：王华指导教师：李平教授学科专业：药理学研巧方向：搪尿病肾病发病机制研究一完成日期：二零五年五月目录中；＾摘要１Ａｂｓｔｒａｃｔ４缩略词表８前胃１０第一表达与糖尿病肾病进展的

2、相关性研巧部分ＥＴＦｐ１３一ＥＴＦ实验Ｐ在两种不同糖巧病肾病大鼠模型中的表达１３一、枯料和方法１４二、结果２３三、讨论２７实验二ＥＴＦＰ在自发性糖尿病肾病模型中的表达３０一、材料和方法３１二、结果３２三、讨论３５小Ｓ３８第二部分糖尿病肾损伤大鼠肾小管调ｔ机制研巧３９一、材料和方法４０—４１结果Ｈ、讨论４３小结４６第Ｈ部分ＥＴＦＰ减控脂肪酸诱导的肾小管上皮细胞调亡及其机制研究４７一ＥＴＦ对脂肪酸诱导

3、的ＮＲＫ实验Ｐ敲降５２Ｅ细胞调亡的影响４８一、材料和方法４８二、结果５２Ｈ、讨论５６实验二ＥＴＦｐ过表达对脂肪酸诱导的ＮＲＫ５２Ｅ细胞调亡的影响巧一、材料和方法５９二、结果６６Ｈ、讨论７０小Ｓ７２第四部分总结７３参考文献７５综述８５致谢１０４ｍ＿＾中文摘要背景：一一糖尿病肾病是糖尿病严重的微血管并发症之，，旦出现大量蛋白尿肾功能将不可逆性进行性下降，最终发展为终末期肾病，。由于其发病机制复杂目前尚无

4、理想的治疗方案。过去研究的重点聚焦在高血糖对糖尿病及其并发症的危害上，近些年人们认为脂肪酸代谢障碍是糖尿病及其并发症的原发病理生理改变。其中血游离脂肪酸升高在非脂肪组织蓄积造成的损伤，，即脂毒性既是糖尿病患者发病的可一能病因之，也是促进疾病进展和加重的关键因素。在糖尿病肾病中，脂毒性己被一证实是进展性肾小管损伤的重要病理机制之，并和肾脏疾病预后密切相关。电子（ｅｏｎｔｒａｎｓｆｅｏｒｏｔｅＥＴＦ）是脂肪酸１２转运黄素蛋白ｌｅｃｔｒｒｆｌａｖｐｉｎ，Ｐ氧化中种线粒体脱氨

5、酶的电子接受体，由ａ和Ｐ亚单位组成，存在于生物体细胞线粒体内。本实验室前期通过糖尿病肾病大鼠肾皮质蛋白组学研究发现ＥｌＴ在保守序列位点出现点ｐ，提示其可能在糖尿病肾病发生发展中发挥重要作用突变。目的：本研究通过建立不同糖尿病肾病大鼠模型观察ＥＴ巧的表达和分布，及与糖尿病肾损伤之间的关系和机制；通过过表达和敲降技术，探讨ＥＴＦｐ在栋搁酸（ｔｔＰＡ）诱ｌａｍｉａｅｐ，导的肾小管上皮细胞调亡中所起的作用。综合体内外实验评价ＥＴＦ一Ｐ在糖尿病肾病中的作用，为进步深入认识糖尿病肾病发

6、病机制提供新思路，同时为疾病治疗提供新的药物候选報点。方法：体内实验分为两部分，首先分别通过链腮佐菌素腹腔注射合并高脂饲料喂养制备轻度肾损伤模型，及链脈佐菌素注射合并单侧肾切除诱导重度糖尿病肾损伤大鼠模型，探讨ＥＴ巧在链腺佐菌素诱导的两种糖尿病肾病模型大鼠肾皮质中表达的变化。此外，通过２型自发性糖尿病ＯＬＥ町大鼠模型，观察肾病进展的两个阶段，分别为％周龄的轻度肾损伤和５６周龄的重度肾损伤ｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ。用Ｗ和免疫组化方法检测ＥＴＴ（３在正常及模型组大鼠肾皮质的分

7、布和表达情况；固定肾组织通过ＰＡＳ染色观察肾脏病理损伤，然后分析ＥＴＦＰ的表达变化与糖尿病肾病发生发展之间的关系。此外，在ＯＬＥＴＦ大鼠模型中，分析肾损伤的机制：用ＴＵＮＥＬ法检测两个时间点的细胞调ｔ情况，然后通过Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测线粒体调亡通路蛋白变化，Ｘ－－包括胞浆细胞色素Ｃ、Ｂｃｌ２及Ｃｌｅａｖｅｄｃａｓａｓｅ３，此外检、ＢＡｐ的表达变化测肾组织Ｎ０Ｘ４的表达。体外实验部分，探讨ＥＴ巧对脂肪酸诱导的肾小管上皮细胞调亡的影响及其机制。首先通过敲降实验观察了Ｈ

8、ＴＴＰ在低表达时对脂肪酸诱导的细胞调亡的影响：１摘要设汁并筛选出敲降效率高的ＥＴＦ３基因ｓｉＲＮＡＯｌｉｇｏ干扰序列，转染至大鼠近端肾（小管上皮细胞ＮＲＫ５２Ｅ，２４ｈ后在培养基中加入终浓度为０．５ｍＭＰＡ，再过２４ｈ－－后检测民ＯＳ生成，ＢＡＸ、Ｂｃ２ｅａｖｅｄｃａｓ，ｌ和Ｃｌｐａｓｅ３蛋白表达通过流式检测线粒体膜电位和细胞调亡率，ＴＵＮＥＬ法检测细胞调亡情况，比较脂肪酸诱导的细胞调ｔ通路改变与敲降ＥＴＦＰ合并脂肪酸刺